HMGB1 ELISA实验结果做出来标准曲线不佳是什么原因啊
您好，很高兴为您解答，根据本人做ELISA实验结果做标准曲线不佳的情况，和同事之间探讨发现总结出以下的一些原因以及解决办法：
1、标准曲线最高点吸光值偏高，超出仪器检测范围ELISA标准曲线最高点的吸光值一般在3.0以下，若太高超出仪器检测范围，显示OVER FLOW，可能原因：
原因1： 如OD绝对值靠谱，则显色过度
解决办法：TMB显色体系中建议根据S1,S2颜色进行判断，当S1,S2深蓝色，有明显梯度，S5有淡蓝色时即可终止。
原因2 ：仅作单波长检测
解决办法：由于参考波长读取非特异性检测，如指纹、划痕、水渍等， 对结果也有影响。建议最终结果以双波长为最准确。
2、标准曲线最高点吸光值偏低
ELISA标准曲线最高点的吸光值一般要在0.8以上，若小于0.8，可能的原因：
原因1：粉末标准品未充分溶解
解决办法：粉末标准品按说明书加一定体积的液体后，轻柔混匀，室温静置30分钟，充分溶解。
原因2：标准品反复冻融
解决办法：标准品反复冻融后活性降低。
原因3：孵育温度、时间
解决办法：按说明书要求孵育条件进行孵育。
原因4：显色时间控制
解决办法：TMB显色体系中建议根据S1,S2颜色进行判断，当S1,S2深蓝色，有明显梯度，S5有淡蓝色时即可终止。
3、标准曲线无梯度
ELISA 实验中标准品2倍倍比稀释，但结果分析标准曲线没有梯度，可能的原因：
原因1：样品或标准品污染
解决办法：避免污染
原因2：错误的样品或标准品的稀释
解决办法：完全按照说明书稀释
原因3：偶联抗体浓度过高
解决办法：按照说明书调整到最佳的浓度
原因4:TMB底物孵育时间过
长
解决办法：调整到合适的孵育时间
原因5：错误的孵育时间或温度
解决办法：完全按照说明书
原因6：孵育时未加盖导致溶液挥发和污染
解决办法：贴封片或加盖
科润达生物提供解答：总结得到完美ELISA标准曲线，需要注意几点：
1、 充分溶解标准品；
2、 标准品避免反复冻融；
3、 梯度稀释标准品注意混匀。
希望对您有帮助！望采纳！
影响elisa实验结果有哪些因素
影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。我将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。操作步骤可能原因解决办法选择试剂选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。加 样1.血清或血浆标本分离不好即进行加样； 2.手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长（特别是室内温度较高时）； 3.加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。1.标本为血清：最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。
2.加样后及时放入孵箱。 3.加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。 4.如果采用AT或其他全自动加样，最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。 5.标本较多时，请分批操作。孵 育1.孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底； 2.孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。1.贴封片或加盖； 2.按说明步骤严格控制操作时间。洗 板1.采用手工洗板，孔与孔之间液体交叉。 2.采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。 3.反应板过多造成洗板等待时间长。1.保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干； 2.合理安排，或多用几台洗板机。
显 色1. 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂； 2. 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。1. 显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用； 2. 加样时保持显色剂不外流； 3.A、B液应避免接触金属器械。终 止加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。加终止液时应避免产生气泡。读 板读板时板底不清洁。应保证酶标板清洁。全过程1.整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸； 2.实现ELISA检测标准自动化，有效提高检测质量。在实际操作中，除了选择优良试剂外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时作好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。现在国内已有相当数量的单位拥有全自动酶标仪，这对于实现ELISA标准化检测、提高检测质量起到了重要作用。
