目的 研究5种中草药对致病弧菌的抑菌活性，为水产品的安全用药提供参考。方法 采用纸片法和试管法，以溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鲨鱼弧菌 (Vibrio carchariae)为供试菌株，测定中草药不同极性萃取部分的抑菌圈和最小抑菌浓度。 结果 夹竹桃叶、芒果叶、苦楝叶和羊蹄甲叶4种中草药乙酸乙酯萃取部分对供试弧菌有很好的抑菌作用；苦楝叶和羊蹄甲叶石油醚萃取部分对副溶血弧菌有抑菌作用；芒果叶的水溶性部分对塔氏弧菌有很强的抑菌作用；枇杷叶提取物对4株弧菌均无抑制作用。结论 除枇杷叶外，其他4种中草药可不同程度的抑制致病弧菌的生长，其抑制致病弧菌的活性成分有待于进一步研究。
Abstract:Objective To study the anti?bacteria activities of five herbs, to provide references for the safe drugs of aquaculture. Methods Using Vibrio coralliilyticus, Vibrio tubiashii, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio carchariae as the tested bacteria, the inhibition zone and the minimal inhibitory concentration（MIC）were measured. Results The extracts, extracted with ethyl acetate from the lees of Nerium indicum Mill, Mangifera indica Linn, Melia azedarach L. and Bauhinia purpurea could inhibit vibrio. And the extracts, extrated with petroleum ether from lees of Melia azedarach L. and Bauhinia purpurea can inhibit Vibrio parahaemolyticus, too. The remainder extracts of Mangifera indica Linn.showed strong inhibition effect on Vibrio tubiashii. While the extracts of Eriobotrya japonica showed no inhibition effect. Conclusion Four of the five herbs show anti?bacteria activities and the study on active pounds should be done in future.
Key words:herb；Vibrio；anti?bacteria activity；minimal inhibitory concentration
随着现代集约化和规模化水产养殖的发展，养殖中水产动物感染细菌的几率大大增加。为了预防水产动物疾病，大量抗生素类药物被用作水产药物。滥用抗生素使致病菌的耐药性增加，药物的有效性降低，同时也加剧了环境污染，残留药物降低了水产成品的品质，引发了市场对水产品安全性的质疑，降低了水产商品在国际贸易中的竞争力。因此，开发替代抗生素的高性能、无毒副作用、安全高效的抑菌药物引起了广大科研人员的关注。
本研究以夹竹桃（Nerium indicum Mill）、芒果（Mangifera indica Linn.）、苦楝（Melia azedarach L.）、羊蹄甲（Bauhinia purpurea）和枇杷（Eriobotrya japonica）等5种中草药为研究对象，选取对水产品危害较大的4株致病弧菌为实验菌株，旨在通过抑菌活性的筛选研究，获得安全有效的天然抑菌药物。
1 材料与方法
1. 1 仪器及试剂
主要仪器有DFT?200型摇摆式高速中药粉碎机（温岭市大德中药机械有限公司）、RE52CS型旋转蒸发器（上海亚星生化仪器厂）、LDZX40CI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、150A生化培养箱（金坛市迅生仪器厂）、SW?CJ?1D型洁净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）。所用试剂均为分析纯。使用的培养基为2216E培养基。环丙沙星纸片为杭州天和微生物试剂有限公司产品。
供试菌种：溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鲨鱼弧菌 (Vibrio carchariae)由南海水产研究所提供。
1. 2 供试药材及预处理
供试药材为广东常见的5种植物的叶，供试的5种植物分别是夹竹桃（Nerium indicum Mill）、芒果（Mangifera indica Linn.）、苦楝（Melia azedarach L.）、羊蹄甲（Bauhinia purpurea）、枇杷（Eriobotrya japonica）。5种供试植物均采自广东药学院药用植物园，原植物均经药用植物教研室严寒静副教授鉴定。供试植物叶片阴干后粉碎成粗粉备用。取供试药材粗粉各20 g，用60%（）乙醇回流提取90 min后滤过，滤液减压浓缩至50 mL后，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯萃取。将3种萃取液分别减压浓缩至1 g/mL（以生药计），即得石油醚萃取部分（Ⅰ）、乙酸乙酯萃取部分（Ⅱ）和水溶部分（Ⅲ）。
1. 3 病原菌的分离和菌悬液制备［1］
将4株供试菌分别划线接种于平皿培养基中，于28 ℃培养24 h后，挑选单个菌落转接于斜面培养基中，28 ℃培养24 h后，用2 mL 0.9% NaCl溶液进行洗脱即制得所需菌悬液。
1.4 纸片法抑菌试验
按无菌操作规程［2］，吸取4株供试菌悬液各0.1 mL，分别加到平板培养基上并涂布均匀。将预先灭菌烘干并浸蘸定量药液的滤纸片（直径为5 mm）平贴在含菌培养基上。同时用浸有相应溶剂的滤纸片做对照。每份样品做3份，结果取平均值。28 ℃倒置培养，并于12 h和24 h观察抑菌效果，测定抑菌圈的直径。以环丙沙星为阳性对照。
1.5 试管稀释法测最低抑菌浓度
采用试管稀释法，以相应溶剂作对照，测定有抑菌活性的药液的最低抑菌浓度(MIC)。每种提取物为一组，每组取无菌试管12支，于第1管中加入1.0 mL浓度为2105 CFU(colony forming units)/mL的菌液，在2～10管中每管加入1.0 mL 浓度为1105 CFU/mL菌液，在第1管内加入中药浓缩液1.0 mL，充分混匀后取1.0 mL放入第2管，混匀后再取1.0 mL放入第3管，第1管内的药物浓度为原液的1/2，第2管为第1管的1/2，其余类推，直至第10管，每种药物的第11管作菌液对照（仅加菌液不加中药），第12管作药物对照（仅加中药不加菌液），以能抑制细菌生长（培养后培养基仍清亮）的最小药物浓度为其MIC。
2 结果与分析
2.1 纸片法抑菌试验结果
见表1。由表1数据可知，阳性对照环丙沙星对4株菌均有抑制作用，而中草药提取物只对溶珊瑚弧菌、副溶血弧菌和塔氏弧菌3株菌产生抑制作用。其中，夹竹桃叶、苦楝叶和羊蹄甲叶对副溶血弧菌和溶珊瑚弧菌有抑制作用；芒果叶对溶珊瑚弧菌和塔氏弧菌有抑制作用；枇杷叶对4株供试致病菌均无抑制作用。比较不同提取部位抑菌作用可知，乙酸乙酯提取部分的抑菌活性较明显，苦楝叶、芒果叶、夹竹桃叶和羊蹄甲叶乙酸乙酯萃取部分均产生抑菌圈；石油醚萃取部分的抑菌结果显示，苦楝叶、羊蹄甲叶石油醚提取部分能产生抑菌圈；水溶性部分只有芒果叶产生抑菌圈。分析不同供试菌敏感性发现，副溶血弧菌和溶珊瑚弧菌两株供试菌对夹竹桃叶、苦楝叶和羊蹄甲叶提取物均敏感，能产生不同大小的抑菌圈；塔氏弧菌只对芒果叶的水溶性部分敏感；鲨鱼弧菌对中草药提取物则完全不敏感。表1 5种植物不同萃取部分的抑菌圈（略）注：石油醚萃取部分简称为I,乙酸乙酯萃取部分简称II,水溶部分简称III。5种中草药提取物对致病性弧菌的抑菌作用研究论文
