基因沉默的研究进展

[《自私的基因》读书笔记]我们从何处来?将要到哪里去? 在达尔文之前的人类，都觉得自己是神的子孙，或者是跟神有某种关系，然后达尔文横空出世，拿着一堆动物的骸骨和化石，对狂妄自大的人类说：别做梦了，咱们不...+阅读

【摘要】基因沉默gene silencing)是指生物体中特定基因由于种种原因不表达或者表达减少的现象。基因沉默发生在

两种水平上，一种是由于dna 甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平上的基因沉默；另一种是转录后基因沉

默。rna干扰(rnai)是一种新发现的通过dsrna介导的特异同源靶基因途径，rnai的

应用有望成为一种防治疾病的新

方法。

【关键词】基因沉默；转录水平基因沉默；转录后基因沉默；rna干扰

【中图分类号】q78

【文献标识码】a

【文章编号】1007—9297(2005)03—0227—04

current progress of gene silencing． chen xue-mei,du xian-gang,guan peng．school of basic medicine and forensic

medicine，sichuan university,ch engdu 610041，china

【abstract】gene silencing refers to the phenomena of specific gene un-expressing，there are two kinds of gene silencing

including tranional gene silencing and post-tranional gene silencing．rna interference(rnai)is the process of post—

tranional gene silencing by which double-stranded rna (dsrna) directs sequence—specific degradation of homologous

mrna． scientists he carried out researches on the therapy for diferent diseases by rnai technology and it will be a novel

therapy for cancer and viral diseases．

【key word】gene silencing；tranional gene silencing；post-tranional gene silencing；rna interference；

基因沉默(gene silencing)是指生物体中特定基

因由于种种原因不表达或者是表达减少的现象。基因

沉默现象首先在转基因植物中发现，接着在线虫、真

菌、水螅、果蝇以及哺乳动物中陆续发现。[]-3 3基因沉

默主要发生在两种情况，一种是转录水平上的基因沉

默(tranional gene silencing，tgs)，另一种是转录

后基因沉默(post—tranional gene silencing,ptgs)

。rna干扰(rna interference，rnai)是近几年发

展起来的转录后基因阻断技术．rnai在2002年被

science评为全球十大科技突破之一．作为一种在细胞

水平的基因敲除工具，rnai正在功能基因组学领域

掀起一场革命。

一

、基因沉默的分类及其机制

(一)转录水平基因沉默

转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核

rna合成的失活．它的发生主要是由于基因无法被顺

利转录成相应的rna而导致基因沉默。转录水平基

因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可

遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几

种：

1．基因及其启动子甲基化

甲基化是活体细胞中最常见的一种dna共价修

[作者简介]陈雪梅(1979一)，女，汉族，四川省峨嵋山市人，现在四川大学华西医科大就读硕士。研究方向：闭合性颅脑损伤中脑红蛋

白的表达。e—mail：ameychenx#163．corn

【通讯作者]官鹏，男，四川大学基础医学与法医学院副教授，e—mail：guanpengcn#hotmail．corn

|i本课题受国家自然科学基金资助(基金编号30470660)及四川大学科技创新基金资助(基金编号2004cf08)

· 228·

饰形式，通常发生在dna的cg序列的碱基上，该区

碱基甲基化往往导致转录受抑制。该区甲基化的频率

在人 12全文查看类及高等植物中分别可达4％和36％。[42近来的

研究表明。发生在转基因启动子5’端的甲基化是造成

转录水平基因沉默的主要原因。虽然转基因的甲基化

可延伸至转基因的3’端。但甲基化过程均是从启动子

区域开始的。从所报道的转基因沉默例子来看，几乎

所有的转基因沉默现象与转基因及其启动子的甲基

化有

关。

2．同源基因间的反式失活

反式失活主要是由于拥有同源序列的沉默位点

和其他位点的dna的相互作用而引起的基因沉默。

通过顺式作用而甲基化并失活的基因能作为一种“沉

默子”，对其他与之分离的具有同源性的靶基因施加

一种反式作用。使具有同源序列的靶基因发生甲基化

并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是

等位基因，也可以是非等位基因。

3．后成修饰作用导致的基因沉默

后成修饰作用(epigeic effect)是指转基因的

序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发

育的某一阶段受到细胞内因子的修饰作用后而关闭。

这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰

作用的解除而被消除。后成修饰作用导致的转基因沉

默与受体植物的核型构成有关。

4．重复序列

外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上．

形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重

复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严

重。这种重复序列诱导的基因沉默与在真菌中发现的

重复序列诱导的点突变相类似，均可能是重复序列间

自发配对，甲基化酶特异性识别这种配对结构而使其

甲基化。从而抑制其表达。

5．位置效应

位置效应是指基因在基因组中的位置对其表达

的影响。当外源基因整合到高度甲基化、转录活性低

的异染色质区域时。外源基因一般表现沉默，这说明

毗邻dna的甲基化和异染色质化对插入的外源基因

影响很大，可能导致外源基因在转录水平上失活。如

果转基因插入转录不活跃区域或异染色质区域．转基

因通常会融人该区域的染色质结构，使转基因进行很

低水平的转录，或使转基因发生异染色质化而导致转

基因沉默。

(二)转录后水平基因沉默

转录后水平基因沉默是指基因在细胞核内能稳

法律与医学杂志2005年第l2卷(第3期)

定转录，但在细胞质里却无相应稳定态mrna存在的

现象。与转录水平基因沉默不同，转录后水平基因沉

默具有逆转性，即受抑制基因通过减数分裂可以恢复

表达活性。表现为减数分裂不可遗传性。目前发现主

要有以下几种转录后水平基因沉默现象。

1．共抑制

共抑制是最常见的转录后水平基因沉默。这一现

象首先由napoliul在转chs基因的矮牵牛花中发现。

共抑制现象普遍存在于转基因植物中。共抑制的发生

是由于外源基因编码区与受体细胞基因间存在同源

性而导致外源基因与内源基因的表达同时受到抑制。

具有同源性的外基因和内源基因在细胞核内的转录

速率很高，但在细胞质内无mrna积累。是典型的转

录后水平基因沉默。若导入的外源基因与内源基因无

序列同源性，外源基因自身也常常会发生转录后水平

基因沉默。有关研究发现。共抑制的产生不仅同内、外

源基因间编码区的同源性有关。还与控制外源基因的

启动子的强度等因素有关。

2．基因压制

cogoni等在粗糙脉抱霉的转化实验中发现。外

源基因可以抑制自身和相应内源基因的表达。他们把

这一现象定为基因压制。cogoni等是以类胡萝卜素生

物合成基因albino—l作为视觉报道基因来研究基因

压制的。他们发现，基因压制是可逆的，而且这种逆转

会伴随有外源拷贝的丢失。基因压制发生在转录后水

平，导致已复制的稳定态mrna大量减少。

3．rna干扰

rna干扰是1998年fire首次在秀丽线虫中发现

并证明属于转录后水平的基因沉默。[6]利用小片段双

链rna可以特异性地降解相应序列的mrna。从而

特异性地阻断相应基因的表达。rna干扰广泛存在于

从真菌到植物、从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物

中。rnai的作用机制目前尚不完全清楚，学者们在线

虫、果蝇、植物和动物卵细胞的rnai实验中，最近相

继发现了一些与rnai作用相关的酶和蛋白，如dsr—

na 特异性核酸内切酶(dsrna specific endonuclease，

dicer)、rna 依赖性rna 聚合酶(rna dependent

rna polymerase，rdrp)、argonaute蛋白等。现已初步

阐明rnai的作用机制如下：各种dsrna通过各种转

染技术转入细胞内，较长dsrna被dicer的rna 酶

ⅲ样特异性核酸内切酶切割产生21～23nt的小干扰

rna (small interfering rna．sirna )，sirna两条单

链末端为5 一磷酸和3 一羟基．且3 端都有2～3个

突出的核苷酸。核酸内外切酶、atp、解旋酶与arg—

法律与医学杂志2005年第12卷(第3期)

onaute蛋白相连进而与sirna一起形成具有多个亚

单元的rna诱导的沉默复合体(rna—induced silenc．

ing plex，risc)。 risc 中的解旋酶应用atp解

开sirna双链，使其反义链互补结合到靶向的mrna

上与之相匹配的特异性序列，risc 中的核酸酶降解

mrna，从而使目的基因沉默，产生rnai现象。

sirna也能与risc和mrna联系在一起，在解开

sirna的双链后，反义rna链能作为双链rna合成

的一个引物以mrna为模板．在risc中的rdrp的

作用下形成新的dsrna，再次被dicer识别并切断，形

成新的sirna再循环，作用于另外的靶向mrna。这

种不断放大的瀑布式作用形成大量新的sirna，使

sirna在短时间内迅速并有效地抑制mrna翻译形

成蛋白质或多肽，从而有效地抑制靶向基因蛋白质或

多肽的合成。

二、基因沉默的相关实验技术及其进展

目前在基因沉默中主要是rna干扰的实验技术

应用较多，根据靶dsrna合成的方法可将rnai技术

分为3种。

1．体外化学合成法

最为经典的方法，共分4个步骤：(1)化学合成

dsrna；(2)将dsrna导人宿主细胞；(3)检测靶基因

抑制效率；(4)功能研究。其中，dsrna合成成本很高，

dsrna转人宿主细胞效率及其在宿主细胞中的稳定

性均不确定。

2．体外转录法

这种方法采用t7rna聚合酶．以先合成的dna

链为模板反转录合成dsrna，从而使合成dbrna的

成本大大降低，但这种方法与化学合成法有相同的缺

点。

3．体内载体合成法

这是近年来迅速发展起来，克服了前两种方法缺

点的新技术。它是2002年paddison等首先报道的利

用载体在细胞体内稳定地表达sirna．从而抑制哺乳

动物细胞靶基因表达的方法。其基本思路如下：细

胞内存在rnaplymerasein，它可以识别u6启动子，从

而使启动子后的基因转录成rna。当模板连续出现

3~5个“t”碱基时，转录就会终止。根据这一机制，可以

设计一种能表达rna的质粒，其组成包括4部分：

(1)常用质粒的基本序列；(2)u6启动子，位于克隆位

点的上游；(3)克隆位点；(4)rnai模板序列(dna)。

这部分序列具有如下特点：含rnai序列．对哺乳动物

而言，通常为21—23个核苷酸；发夹结构环状部分．通

常有4~7个核苷酸；靶序列的反向互补序列：3—5个核

· 229·

苷酸“t”。将具有如上结构的质粒导人细胞内，体内的

rnaplymerase1]i就可以合成一条rna链，这条rna

链可以通过两端的21个左右的核苷酸反向互补特性

而形成发夹样双链结构，从而起到基因抑制作用。这

种技术操作简便，成本低，与直接导人sirna相比，

dna质粒更易导入细胞内，而且质粒导人细胞后存在

时间长且稳定，对靶基因的表达抑制效率高，便于进

行较长时间的基因功能研究，因而成为一种热门技

术。近年来多位作者几乎同时报道了利用上述载体技

术成功地抑制哺乳动物细胞基因表达的实验。[ ·lo]除

质粒载体外，现已有成功地采用逆转录病毒载体和腺

病毒载体将表达sirna的dna模板序列转移入哺乳

动物细胞的报道。

三、基因沉默的应用前景

1．抗肿瘤策略

rnai具有特异、高效的特点．因此可用于一些肿

瘤的治疗。最近lin等把针对bcl2基因的mrna

cdna杂交体转染到人前列腺癌细胞中，产生长时期

阻抑表达效应，此效应与体外培养的前列腺癌细胞中

的rnai相似，进而说明哺乳动物中可以发生rnai。

[】 ~milner教授应用rnai技术特异性地成功沉默了感

染hpv 的宫颈癌细胞中的hpv基因．宫颈细胞内的

v53和rb蛋白恢复正常功能．从而恢复了宫颈细胞

内正常的防御功能，使已感染hpv 的宫颈癌细胞遭遇

自杀，而对其他健康细胞的正常生长和生物学行为无

影响。可以预见此技术也可应用于与hbv感染相关

的肝细胞性肝癌的基因治疗。有学者认为，应用rnai

技术抑制肿瘤细胞中血管生长因子如血管生成素an．

gil、angi

2、angi3及vegf等或其受体的表达．以及抑

制肿瘤细胞中如癌基因bcl

2、ras、p53等突变基因

及其蛋白的表达而不影响非突变基因的表达．可达到

很好的抗肿瘤生长及抗肿瘤转移的目的。

2．抗病毒

斯坦福医学院的研究者把dsrna放进小鼠的肝

细胞，dsrna被小鼠体内的核酸酶分解成许多sirna，

研究发现sirna具有高度专一性。会与小鼠体内的丙

型肝炎病毒的mrna相结合，使mrna分解并失去翻

译蛋白质的功能。斯坦福医学院运用此技术来治疗丙

型肝炎的研究，已从体外试管实验阶段推进至体内的

动物实验，且在小鼠身上，看到丙型肝炎病毒被阻断的

明显效果。_】 ]有学者认为，rnai技术用于乙型肝炎的

治疗有望成为乙型肝炎治疗的革命性的新方法。将具

有巨大的社会价值。hiv利用细胞表面的蛋白质进

入细胞。并且感染细胞。研究人员用dsrna关闭制造

这种蛋白质必需的基因，理论上，hiv 就无法进入细

胞。capodici等应用21bp rna介导的rna干扰特异

性地抑制了永生细胞系和初级cd4+t淋巴细胞的

hiv的感染。并通过p24葡糖胺聚糖蛋白、rna 印迹

分析和反转录产物的dna pcr 检测了hiv 复制的

抑制。[13]对于已经感染了hiv的细胞，coburn等演证

了与hiv21编码特有的hiv21反式激活蛋白和病毒

粒子蛋白表现的调控子靶向相反的sirna能特异性

地阻断其表达，[14 进而阻断了hiv 的细胞毒作用和

复制。麻省理工学院的sharp认为，只要克服许多障碍，

这个方法就可以成为治疗艾滋病的基础。

3．rnai技术在功能基因组中的应用

人类已进入后基因组计划研究蛋白质组学。在功

能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降

低突变，以确定其功能。由于rnai具有高度的序列专

一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降

低突变，因此rnai可以作为一种强有力的研究工具．

用于功能基因组的研究。andrew等用可分泌dsrna

的细菌喂养新小杆线虫，研究了染色体1约90％的预

言基因，13．9％的基因与其功能对应起来，使已知表型

的基因数目由7o增至378，这种方法与经典基因筛选

方法相比各有千秋，但它主要的一个优点是逆基因分

析，即已知特定的基因或基因序列，通过阻抑这一特异

基因的表达而出现功能或个体表型的改变，进而得到

基因与其功能的相应联系。加州理工大学的chuang

使用rnai研究了拟南芥的4个开花相关基因，结果

表明用rnai技术可以产生功能丧失或降低突变体，

而且为特异性基因治疗提供了新的技术手段。这使得

sirna在科研、治疗乃至商业上均有着巨大的应用前

景。

4．rnai技术在法医学中的应用

基因沉默在法医学中也有广泛的应用前景。法医学的

基础研究领域中还面临许多问题至今还未能很好解

决，如脑损伤机制的研究、猝死疾病机制的研究、基因

表达、成瘾机制的研究等，rnai给我们提供了新的思

路。rnai技术在法医学中的应用能为法医学的基础

研究带来新的飞跃

总之，基因沉默是基因表达调控的一种重要方

式，是生物体在基因调控水平上的一种自我保护机

制，对基因沉默进行深入研究可帮助人们进一步揭示

生物体基因遗传表达调控的本质。rnai在许多领域

具有广泛的应用前景。在基因工程中克服基因沉默现

法律与医学杂志2005年第l2卷(第3期)

象。从而使少量基因能更好按人们的需要进行有效表

达：利用基因沉默在基因治疗中有效抑制有害基因的

表达，可达到治疗疾病的目的；[15]利用基因沉默中的

一些基因沉默现象解决一些法医鉴定方面的难题。因

此，研究基因沉默具有重要的理论和实践意义。

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in neuroscience[j]．neuroscience，2004，126(1)：卜7

(收稿：2004一l1一l1) 12全文查看【摘要】基因沉默n silncin)是指生物体中特定基因由于种种原因不表达或者表达减少的现象。基因沉默发生在

两种水平上，一种是由于dn 甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平上的基因沉默；另一种是转录后基因沉

默。rn干扰(rni)是一种新发现的通过dsrn介导的特异同源靶基因途径，rni的

应用有望成为一种防治疾病的新

方法。

【关键词】基因沉默；转录水平基因沉默；转录后基因沉默；rn干扰

【中图分类号】q78

【文献标识码】

【文章编号】1007—9297(2005)03—0227—04

currn prorss of n silncin． chn u-mi,du in-n,un pn．school of bsic mdicin nd fornsic

mdicin，sichun univrsiy,ch ndu 610041，chin

【bsrc】n silncin rfrs o h phnomn of spcific n un-prssin，hr r wo kinds of n silncin

includin rnscripionl n silncin nd pos-rnscripionl n silncin．rn inrfrnc(rni)is h procss of pos—

rnscripionl n silncin by which doubl-srndd rn (dsrn) dircs squnc—spcific drdion of homoloous

mrn． sciniss hv crrid ou rsrchs on h hrpy for difrn disss by rni chnoloy nd i will b novl

hrpy for cncr nd virl disss．

【ky word】n silncin；rnscripionl n silncin；pos-rnscripionl n silncin；rn inrfrnc；

基因沉默(n silncin)是指生物体中特定基

因由于种种原因不表达或者是表达减少的现象。基因

沉默现象首先在转基因植物中发现，接着在线虫、真

菌、水螅、果蝇以及哺乳动物中陆续发现。[]-3 3基因沉

默主要发生在两种情况，一种是转录水平上的基因沉

默(rnscripionl n silncin，s)，另一种是转录

后基因沉默(pos—rnscripionl n silncin,ps)

。rn干扰(rn inrfrnc，rni)是近几年发

展起来的转录后基因阻断技术．rni在2002年被

scinc评为全球十大科技突破之一．作为一种在细胞

水平的基因敲除工具，rni正在功能基因组学领域

掀起一场革命。

一

、基因沉默的分类及其机制

(一)转录水平基因沉默

转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核

rn合成的失活．它的发生主要是由于基因无法被顺

利转录成相应的rn而导致基因沉默。转录水平基

因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可

遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几

种：

1．基因及其启动子甲基化

甲基化是活体细胞中最常见的一种dn共价修

[作者简介]陈雪梅(1979一)，女，汉族，四川省峨嵋山市人，现在四川大学华西医科大就读硕士。研究方向：闭合性颅脑损伤中脑红蛋

白的表达。—mil：mychn#163．corn

【通讯作者]官鹏，男，四川大学基础医学与法医学院副教授，—mil：unpncn#homil．corn

|i本课题受国家自然科学基金资助(基金编号30470660)及四川大学科技创新基金资助(基金编号2004cf08)

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饰形式，通常发生在dn的c序列的碱基上，该区

碱基甲基化往往导致转录受抑制。该区甲基化的频率

在人[]类及高等植物中分别可达4％和36％。[42近来的

研究表明。发生在转基因启动子5’端的甲基化是造成

转录水平基因沉默的主要原因。虽然转基因的甲基化

可延伸至转基因的3’端。但甲基化过程均是从启动子

区域开始的。从所报道的转基因沉默例子来看，几乎

所有的转基因沉默现象与转基因及其启动子的甲基

化有

关。

2．同源基因间的反式失活

反式失活主要是由于拥有同源序列的沉默位点

和其他位点的dn的相互作用而引起的基因沉默。

通过顺式作用而甲基化并失活的基因能作为一种“沉

默子”，对其他与之分离的具有同源性的靶基因施加

一种反式作用。使具有同源序列的靶基因发生甲基化

并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是

等位基因，也可以是非等位基因。

3．后成修饰作用导致的基因沉默

后成修饰作用(pinic ffc)是指转基因的

序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发

育的某一阶段受到细胞内因子的修饰作用后而关闭。

这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰

作用的解除而被消除。后成修饰作用导致的转基因沉

默与受体植物的核型构成有关。

4．重复序列

外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上．

形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重

复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严

重。这种重复序列诱导的基因沉默与在真菌中发现的

重复序列诱导的点突变相类似，均可能是重复序列间

自发配对，甲基化酶特异性识别这种配对结构而使其

甲基化。从而抑制其表达。

5．位置效应

位置效应是指基因在基因组中的位置对其表达

的影响。当外源基因整合到高度甲基化、转录活性低

的异染色质区域时。外源基因一般表现沉默，这说明

毗邻dn的甲基化和异染色质化对插入的外源基因

影响很大，可能导致外源基因在转录水平上失活。如

果转基因插入转录不活跃区域或异染色质区域．转基

因通常会融人该区域的染色质结构，使转基因进行很

低水平的转录，或使转基因发生异染色质化而导致转

基因沉默。

(二)转录后水平基因沉默

转录后水平基因沉默是指基因在细胞核内能稳

法律与医学杂志2005年第l2卷(第3期)

定转录，但在细胞质里却无相应稳定态mrn存在的

现象。与转录水平基因沉默不同，转录后水平基因沉

默具有逆转性，即受抑制基因通过减数分裂可以恢复