目的 探讨人工合成的CpG ODN对不同物种的免疫刺激活性，开发具有广谱免疫刺激活性的CpG ODN。 方法 将特定的CpG ODN单独或与不同的抗原联合分别免疫鸡和小鼠，用ELISA检测不同时间鸡和小鼠特异性抗体的滴度。 结果 CpG ODN均能诱导鸡和小鼠产生抗原特异性抗体，且抗体水平明显高于对照组(P0.05)。结论 这种CpG ODN在一定程度上具有广谱免疫刺激特性。
Abstract:Objective To investigate the immune stimulation activity of CpG oligodeoxynucleotides to different species and develop CpG oligodeoxynucleotides that possess broad-spectrum immune stimulation activity. Method Chickens and mice were respectively vaccinated with CpG oligodeoxynucleotides or synergistically with different antigens, and then titers of specific antibody in the blood serums of chickens and mice were detected with ELISA. Results CpG oligodeoxynucleotides could induce the generation of antigen specific antibody in chickens and mice, and the level of antibodies in groups which use CpG ODN as adjuvant is higher than that in the control group (P0.05). Conclusion CpG ODN that we made restrictively possesses broad-spectrum immune stimulation activity.
Key words:CpG ODN；multi?species specificity；vaccine
包含CpG基序的人工合成的寡核苷酸（ODN）作为免疫刺激信号可以被动物的免疫系统所识别，随后CpG ODN刺激人类和多种动物产生天然的和获得性的免疫应答。CpG ODN主要通过TLR9活化免疫系统，产生Th1型免疫应答。因此，CpG ODN作为佐剂已广泛应用于感染性疾病、肿瘤的预防和治疗［1］。但CpG ODN存在种属特异性问题，这一问题限制了动物实验结论的外推性［2］。所以，寻找和开发具有广谱识别特性的CpG ODN具有重要的应用价值。本文主要通过观察鸡和小鼠血清中特异性抗体的变化来评价CpG ODN对不同抗原的免疫增强效果，进而确定这种CpG ODN是否能够克服物种限制性这一问题。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物健康1日龄小鸡，健康50日龄SPF鸡，购自广东省农科院；2月龄BALB /c小鼠， 雌性， 体质量20 g左右，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号：2003A074。
1.1.2 试剂10 mg/mL猪囊虫抗原、猪囊尾蚴DNA疫苗VTS7
6、VR10
20、CpG ODN由本实验室保存［3,4］，SPA?HRP购自上海生物制品研究所。
1.2 动物分组及免疫方案
1.2.1 鸡实验组取健康1日龄小鸡，随机分成A、B、C三个组，每组20只，各组饲养条件相同。7日龄时各组处理如下：A为对照组，不作任何处理；B组滴鼻免疫VTS76疫苗（100 g/kg）；C组滴鼻免疫VTS76疫苗（100 g/kg），并同时颈部皮下注射免疫佐剂CpG ODN（100 g/kg），21日龄时B、C组按相同的处理加强免疫1次。
1.2.2 BALB/c小鼠实验组BALB/c小鼠60只， 随机分为3组， 每组间隔2周免疫2次。采用肌肉注射法， 将质粒DNA溶液注射到小鼠两侧股四头肌。A组注射VR1020 100 g/kg作为阴性对照; B组注射VTS76 （100 g/kg）; C组注射VTS76和CpG ODN各100 g/kg。
1.3 抗原特异性抗体检测 96孔培养板用碳酸氢钠缓冲液(15 mmol/L Na2CO3, 35 mmol/L NaHCO3, PH 9.6)适当稀释的猪囊虫抗原包被，4 ℃过夜孵育。用含Tween?20的PBS(0.1 mol/L PBS，0.1% Tween?20)洗涤3次，每次3 min；每孔加入100 mL经PBS(0.1 mol/L PBS，1% BSA)适当稀释的待测血清，37 ℃孵育2 h。PBS洗涤5次，每孔加入100 mL、1∶40稀释的SPA?HRP，37 C孵育2 h。PBS洗涤5次，每孔加入100 mL TMB底物（含0.1 mg/mL 3355?四甲基联苯胺的磷酸盐?柠檬酸缓冲液，pH5.4，用前加5 mL 30% H2O2 10 mL），37 ℃孵育1 h。每孔加入50 mL H2SO4(0.2 mol/L)终止显色反应。Bio?Rad 3550测定A450读数。待测样品A值大于阴性对照平均A值的3倍为阳性。
1.4 统计学分析 各实验组数据比较均采用方差分析，P0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 CpG ODN对鸡血清中猪囊尾蚴特异性抗体滴度的影响 C组在初次免疫1周后可以检测到特异性抗体，但抗体滴度很低；在初次免疫2周和二次免疫1周后，B组和C组特异性抗体滴度明显上升，且C组显著高于B组(P0.05)；二次免疫后2周，B组还有明显上升，而C组已进入平台期，维持在一个较高的水平，两组之间差异无显著性 (P0.05)。对照A组在各个时间点均未检测到特异性抗体。以上结果表明，CpG ODN能够显著增强VTS76疫苗诱导的体液免疫应答水平。见图1。
多种属CpG ODN诱导特异性抗体反应的研究论文
