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【摘要】 目的 观察哮喘豚鼠肺和骨髓组织嗜酸粒细胞趋化因子受体3(CCR3)及嗜酸粒细胞(EOS)不同时相表达的变化, 探讨哮喘发病的可能机制。方法 用卵白蛋白(OVA)和生理盐水致敏法制备豚鼠哮喘和对照模型, 分为正常对照组(N)及哮喘组(A、B、C、D、E)，每组8只，于激发后30 min，6 h，12 h，24 h，48 h处死，瑞氏染色计数骨髓涂片和外周血涂片中EOS比例,免疫组织化学技术检测骨髓中CCR3的表达;制备豚鼠肺组织病理标本, 苏木精-伊红染色,免疫组化检测肺组织中CCR3的表达。结果 ①哮喘组骨髓和外周CCR3及EOS表达明显增加;②OVA激发后,骨髓和外周CCR3及EOS表达：30 min变化不明显，6 h，12 h达到峰值，24 h开始下降，48 h恢复正常水平;③骨髓的变化早于外周，CCR3的表达早于EOS的增多，且CCR3和EOS呈线性相关。结论 哮喘豚鼠肺组织和骨髓之间存在骨髓EOS细胞到循环再到肺组织的通路，CCR3表达增强, 为EOS从骨髓快速募集到肺组织提供了可能。
【关键词】 支气管哮喘 CCR3 EOS 骨髓 豚鼠
哮喘是多种细胞(如嗜酸粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症疾患，哮喘气道炎症的特征性改变为嗜酸粒细胞(EOS)的浸润和活化。气道黏膜下的 EOS主要来源于骨髓CD34+干细胞在某些信号(如eotaxin,IL-5)的驱动下分化成熟为EOS，释放入外周血，在多种趋化信号的引导下向肺内定向募集。这一现象意味着从骨髓-循环-气道，存在着调控EOS定向迁移的信号通路。在EOS趋化、募集于肺组织内的过程中，嗜酸粒细胞趋化因子受体3(CCR3)起着重要作用。本实验探讨哮喘发作时骨髓和气道之间的调控EOS定向迁移信号通路;为临床开发治疗哮喘新方法提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料 雄性豚鼠48只, 体重(25050) g,由徐州医学院动物中心提供。随机分为对照组(N)、哮喘组(根据处死时间分为A、B、C、D、E组), 每组8只。鸡卵白蛋白(ovalbumin, OVA,美国Sigma公司)、CCR3多克隆抗体及SABC免疫组化试剂盒(武汉Boster公司) 、奥林巴斯图像采集系统、德国百瑞雾化器和自制雾化箱。
1.2 方 法
1.2.1 哮喘模型的建立 哮喘组于第1天腹腔注射抗原混悬液1ml (OVA 100 mg、氢氧化铝200 mg) , 2周后将豚鼠放于自制雾化吸入箱内, 喷射雾化吸入10 g/L OVA 20 min,连续5天[1]。对照组于第1天腹腔注射1 ml生理盐水, 2周后喷射雾化吸入生理盐水20 min,连续5天。最后1次雾化吸入后，哮喘组A、B、C、D、E分别于30 min，6 h，12 h，24 h，48 h处死动物,对照组12 h处死，取材并作相应测定。
1.2.2 骨髓和外周血EOS计数 于末次激发后,断颈处死豚鼠, 取颈动脉血制作血涂片。取两侧股骨, 去掉两端骨骺, 剖开骨干髓腔,以含肝素100 U/ml的生理盐水溶液将骨髓细胞冲洗出, 4℃,1000 r/min离心5 min后，沉渣涂于多聚赖氨酸处理的玻片上，干燥后以40 g/L多聚甲醛固定30 min,-20℃保存备用。骨髓和外周血涂片用瑞氏染色, 随机计数200个白细胞, 并计算其中EOS百分比。
1.2.3 骨髓细胞CCR3表达的检测 采用SABC免疫组织化学法检测骨髓中CCR3的表达。以兔抗大鼠CCR3 IgG为一抗, 以生物素化的羊抗兔IgG为二抗。取骨髓沉渣涂片, 按SABC免疫组化试剂盒说明书处理。在光镜下观察结果,胞膜为棕黄色者为阳性细胞, 在光镜(400) 下随机选取5个视野, 计数阳性细胞数占白细胞总数的比例, 结果以s表示。
1.2.4 肺组织EOS计数及CCR3表达的检测 无菌操作下切取部分肺组织,40 g/L多聚甲醛固定, 常规石蜡包埋、切片, 分别进行H-E染色、CCR3免疫组化染色(严格按武汉Boster公司SABC试剂盒说明书操作)。肺组织切片H-E染色后, 每张切片计数200个细胞, 计算其中EOS百分比。免疫组化计数方法: 光镜下观察胞膜着棕黄色为阳性细胞。每例选择1张染色较好的切片, 显微镜下随机选取5个高倍视野(400) , 计数, 取每视野的均数, 结果以s表示。
1.2.5 统计学处理 计量数据均采用s表示，用 Stata7.0软件对数据进行t检验和相关分析，P0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 哮喘豚鼠气道病理学改变 肺组织H-E染色光镜下可见：与对照组相比，哮喘组大、中、小支气管收缩,黏膜水肿，平滑肌增厚,上皮细胞肿胀,部分上皮细胞变性、坏死脱落,杯状细胞增生,支气管管腔狭窄甚至闭塞,黏液栓形成;支气管周围血管扩张、充血,黏膜、黏膜下层及肺泡区有大量的炎症细胞浸润,主要为EOS、淋巴细胞、单核细胞;肺泡间隔增厚。激发后30 min上述改变不明显，6 h,12 h肺组织病变最明显，24 h,48 h逐渐恢复到正常肺组织表现。见图1。
2.2 外周血涂片、骨髓细胞涂片及肺组织EOS计数 结果见表1。可以发现哮喘(豚鼠)激发后30 min，与对照组相比变化不大，且外周血EOS百分比稍有下降，但无统计学意义;6 h,12 h升高明显(P0.01);24 h开始下降(P0.05);48h基本恢复到正常水平。值得注意的是哮喘组不同时间点之间EOS也存在着变化：6 h较30 min，EOS升高明显(P0.01);12 h较6 h,肺组织EOS变化不大(P0.05),骨髓和外周血升高(P0.05);24 h较12 h，48 h较24 h,EOS呈下降趋势(P0.01).可以看出在6 h,12 h时EOS增多最明显，与气道病理学改变相一致，24 h开始下降，48 h回到正常水平。骨髓的变化先于肺和外周血，且持续的时间短。
2.3 肺组织和骨髓中CCR3蛋白的表达 结果见表2。 哮喘组肺组织和骨髓中CCR3 蛋白阳性细胞呈棕黄色,主要定位于细胞膜。肺组织中，气道黏膜、黏膜下层及血管周围、肺泡区有大量呈棕黄色的阳性细胞,气道黏膜上皮细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞也有CCR3蛋白表达,对照组在上述部位仅少量表达。骨髓细胞中,呈棕黄色CCR3 蛋白阳性细胞大量表达于各阶段Eos细胞表面，见图2。不同之间点的表达趋势和EOS的变化一致：与对照组相比骨髓及肺组织中CCR3 30 min时开始升高(P0.05); 6 h、12 h达到高峰(P0.01);24 h开始下降(P0.05);48 h基本恢复到正常水平。哮喘组不同时间点之间CCR3表达也存在着变化：6 h较30 min升高明显(P0.01);12 h较6 h,肺组织继续升高(P0.05),骨髓中持续高峰(P0.05);24 h较12 h，48 h较24 h渐下降至正常水平(P0.01)。骨髓先升高，肺组织随着变化，但持续时间长于骨髓。 表1 对照组、哮喘组的EOS计数表2 肺组织和骨髓中CCR3 蛋白的表达2.4 肺组织和骨髓EOS表达与CCR3蛋白表达的关系 EOS表达与CCR3蛋白的表达存在着线性关系：肺组织，r=0.93,P0.01;骨髓，r=0.95,P0.01。
3 讨 论
CCR3主要由单一肽链组成的7个螺旋跨膜结构，属于G 蛋白藕联受体家族。CCR3 主要表达于EOS上，介导其迁移及脱颗粒反应。Shannon A 等[2]研究发现eotaxin及eotaxin-2 通过与CCR3的结合可以诱导部分CCR3内陷和EOS 的变形，有助于EOS 的活化和迁移。Joubert P 等[3]发现eotaxin 作用于气道平滑肌细胞CCR3可诱导平滑肌细胞迁移和增殖，使细胞内Ca2+增高。Adachi T 等[4]发现支气管上皮细胞表达CCR3 可激活和诱导有丝分裂原激活蛋白(MAP)活化和细胞因子的产生。可见CCR3无论在气道炎症还是重塑方面都起到了重要作用。本实验发现哮喘时不但肺组织EOS浸润明显，CCR3表达增加，而且黏膜上皮细胞、平滑肌细胞上CCR3也有明显表达，平滑肌增厚，和既往研究一致。
以往研究表明, 在过敏性哮喘患者的骨髓中, 成熟和非成熟的EOS CCR3表达水平显著升高[5]。Lamkhioued等[6]研究证实,CCR3 可表达于骨髓CD34+造血细胞表面,在体内外eotaxin 与CCR3 结合后均表现出明显的趋化活性,促使骨髓中CD34+细胞产生增多。并且单独或与IL-5协同作用可以使骨髓CD34+祖细胞定向分化为EOS，并向外释放、募集[7]。本实验发现哮喘组骨髓CCR3表达明显高于对照组，与EOS各级细胞呈线性相关，并且CCR3的表达高峰在6 h,早于EOS增加，释放的高峰时间12 h，说明在某些因子的作用下，骨髓祖细胞表达CCR3，进一步使EOS分化、释放增多，利于炎症的发展。
近年研究的重点倾向于骨髓、肺组织、循环之间的关系，以便更好地为治疗哮喘开阔思路。本实验发现无论肺组织还是骨髓在哮喘激发初始时变化不明显，但是外周血EOS呈下降趋势，考虑为向肺内募集量大于骨髓释放量;在6 h后，骨髓CCR3和EOS均明显增加，外周血EOS增多，肺内表达增多，12 h达到高峰，24 h开始下降，说明伴随骨髓干细胞CCR3表达增加，EOS增多、释放，外周的EOS也在变化。证明在骨髓到外周血再到肺组织存在着密切的细胞信号环路联系。如果能切断这方面的环路，如通过抑制CCR3的表达，或者给于其拮抗剂，将对哮喘的治疗有很重要的意义。
CCR3在哮喘豚鼠模型肺和骨髓中的表达及意义
