硅霜微生物限度检查方法学验证

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【摘要】目的验证硅霜微生物限度检查方法的专属性和有效性。

方法采用直接接种法和培养基稀释法对硅霜进行验证试验，并测算菌回收率。结果硅霜以直接接种法检查，白色念珠菌、黑曲霉菌的菌回收率70%，采用培养基稀释法后金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的菌回收率70%。结论硅霜可以用直接接种法进行控制菌、霉菌及酵母菌总数检查，以培养基稀释法测定细菌总数。

【关键词】硅霜;微生物;限度检查;验证

硅霜用于治疗皲裂、皮炎，并能防止银宵病治愈后复发。主要是护肤防裂。为保证药品质量，按照中国药典2005版[1]的要求，对其微生物限度检查方法进行验证，如下。

1实验材料

1.1培养基:培养基均购自中国药品生物制品检定所。

1.2菌种:大肠埃希菌(CMCCB44102)第2代，枯草芽孢杆菌(CMCCB63501)第2代，金黄色葡萄球菌(CMCCB26003)第2代，白色念珠菌(CMCCF98001)第2代，黑曲霉菌(CMCCF98003)第2代

1.3稀释液:pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

1.4样品:硅霜(201006022010060320100604 牡丹江市皮肤病防治研究所)

2方法

2.1直接接种法供试液制备:取供试品10g三份，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的容器中，充分振摇使供试品溶解，然后加入40℃～45℃的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置，使油水明显分层，取其水层作为1：10的供试液，取2mL分别加入置2个平皿中。

2.2直接接种法菌液制备:取1 ∶ 10 供试液2mL，分别加入置2 个平皿中，再分别加入大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌50～100 个菌/mL 的菌液1mL，作为加阳性菌供试液样。每种菌制备2 份。

2.3培养基稀释法供试液的制备:将1∶10供试品溶液1mL，分别注入10个平皿中，每个0.1mL，10个为一组，共两组。

2.4培养基稀释法加阳性菌供试液的制备:将1∶10 供试品溶液1mL，分别注入10 个平皿中，每个0.1mL，10 个为一组，再分别加入大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉50～100 个菌/mL 的菌液1mL，每种菌株两组。

2.5操作步骤

2.5.1直接接种法:取1∶10供试液2mL注入2个平皿中，分别加入大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉50～100个菌/mL 的菌液1mL，作为加阳性菌供试液样。每个菌制备2个平皿。

2.5.2培养基稀释法:将1∶10供试液2mL，分别注入20个平皿，再分别加入大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌50～100个菌/mL的菌液1mL，每组10个平皿，每个菌株两组。分别加入已溶化保温至45℃营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基15mL。每1mL供试品溶液所注的平皿中生长的菌落之和为1mL，计算每1mL供试品溶液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌落数。

2.5.3大肠埃希菌检查:取1 ∶ 10 供试品溶液10mL 接种于胆盐乳糖培养基中，培养24h，取上述培养物0.2mL，接种至含5mL MUG 培养基的试管内，培养，于5、24h 在365nm 紫外线观察，同时用未接种的MUG 培养作本底对照。管内培养物呈现荧光，为MUG 阳性;不呈现荧光，为MUG 阴性。

2.6培养:各平皿培养基凝固后，细菌检查平皿置30～35℃培养箱48h，霉菌检查平皿置23～28℃培养箱72h。

2.7样品微生物限度测定:取供试品10mL，加pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液90mL，混匀，分别按常规法和培养基稀释法各3份进行操作。

3结果

硅霜以常规方法检查，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌、黑曲霉各菌的平均回收率分别为60.5%、44.3%、67.4%、95.4%、98.0%。该样品对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的检出均有影响，而对白色念球菌、黑曲霉的加样回收率均高于70%，故认为常规法测定霉菌和酵母菌总数是符合中国药典2005年版的要求的;采用培养基稀释法金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌各菌的平均回收率分别为86.2%、95.6%、88.8%，均高于70%，故认为培养基稀释法测定细菌总数是符合中国药典2005版的要求的。

控制菌检查硅霜无明显的影响，故控制菌采用常规法进行检验。

4结论

硅霜可以使用常规法即直接接种法进行控制菌、霉菌及酵母菌总数检查，以培养基稀释法测定细菌总数检查。

参考文献

[1] 中国药典2005年版二部[S].2005.附录93-101.

硅霜微生物限度检查方法学验证