灰黄霉素提取技术
【摘要】目的 探讨超声波提取灰黄霉素的优化工艺条件。
方法 用紫外分光光度法(UV)测定灰黄霉素的含量。
以灰黄霉素的提取率为评价指标，在单一影响因素考察的基础上，采用正交实验确定超声波提取灰黄霉素的优化工艺条件。
结果 超声波提取灰黄霉素的优化工艺条件为：10倍量的丙酮为提取溶剂，功率300W，单次辐射时间3s，间歇时间5s，提取时间40min，灰黄霉素提取率为85.58%。
通过验证实验表明，本实验所得工艺条件为优化工艺条件。
结论 本实验所得工艺条件可行，具有一定的实际应用价值。
【主题词】 灰黄霉素 提取 技术
灰黄霉素(griseofulvin)是1939年从灰黄青霉(Penicillium griseofulvin)培养液中得到的一种含氯代谢产物，1958年开始用于临床。
1960年中国医学科学院抗生素研究所从我国土壤中得到灰黄霉素的生产菌，并研究试制成功灰黄霉素。
灰黄霉素是非多烯类抗真菌抗生素，已广泛用于治疗皮肤及角质层的真菌感染。
对红色发癣菌、断发癣菌、硫毛发癣菌、小孢子菌和絮状表皮菌等有抑制作用。
临床用于头癣、迭瓦癣、皮肤癣及手(足，甲)癣等体表真菌感染，特别对头癣的疗效显著，国内治愈率在90%以上。
灰黄霉素是存在于菌丝体内部的抗生素。
目前工业上采用溶剂连续浸泡干菌体的提取方法，溶剂大多为丙酮。
考虑到常规提取所需时间较长，提取率较低，溶剂用量较大，本研究探讨采用超声波技术提取灰黄霉素的工艺，利用超声波的空化作用、热效应、机械作用破坏菌体细胞壁，使溶剂易于渗透至细胞内，有效成分更多的转移到溶剂中，达到缩短提取时间，提高提取率的目的。
一 仪器与材料
1 仪器： U1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器公司)，ALC210.4型电子天平(德国Sartorius公司)，JY922D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，HF2.5B超声波循环提取器(北京宏祥隆生物技术开发有限公司)。
2 材料： 灰黄霉素菌体(赤峰制药集团生产，编号：NI88)，对照品(中华制药厂产品，纯度为99.8%)，丙酮(天津市博迪化工有限公司)，95%乙醇(沈阳化学试剂厂)，氯仿(天津市博迪化工有限公司)，所用试剂均为分析纯。
二 实验方法
1 标准曲线的制备： 精密称取灰黄霉素对照品25mg，25ml丙酮溶液定容，配制标准溶液(初始浓度1.0mg/ml)。
精密量取标准溶液2ml于25ml容量瓶，用95%乙醇定容。
取丙酮2ml置于25ml容量瓶中，95%乙醇定容，作为空白溶液。
紫外光谱200～400nm全波长扫描，在326nm处有最大吸收峰。
2 灰黄霉素含量测定： 称取灰黄霉素菌体(含水5%)1.0g置于250ml烧瓶中，加入丙酮50ml，磁力搅拌回流提取三次，每次1h。
测得菌体中灰黄霉素含量为30.67%。
3 灰黄霉素超声波提取影响因素考查： (1)超声提取溶剂 文献报道灰黄霉素易溶于二甲基甲酰胺、二氯乙烷(以上溶解度约为10%～12%w/v)，可溶于丙酮、氯仿、乙醇(在丙酮中溶解度为5.0%，氯仿为4.4%，乙醇为1.66%)，不溶于水和石油醚。
考虑到二甲基甲酰胺价格较高，二氯乙烷毒性较大，本实验主要选取丙酮、氯仿及95%乙醇为超声提取溶剂。
称取灰黄霉素菌体5g，共3份，分别用丙酮、氯仿、95%乙醇50ml溶解，超声条件设定为：功率400W，单次辐射时间3s，提取时间40min，室温下进行提取，分别测定灰黄霉素溶液的吸光度，提取率分别为83.71%、78.69%和28.95%。
由于丙酮对灰黄霉素的提取率较高，因此本实验选取丙酮作为超声提取溶剂。
(2)溶剂用量 称取灰黄霉素菌体5g，共6份，分别用
4、
8、
10、
12、
16、20倍量丙酮溶解，超声波条件不变。
分别测定灰黄霉素溶液的吸光度，计算提取率。
溶剂4倍量时，提取液中结晶析出太多，故舍去该实验点。
如Fig.1所示，在溶剂倍量为16时有最大提取率。
考虑到用较少的溶剂得到较高的提取率，本实验确定溶剂倍量为10。
(3)超声波提取功率 称取灰黄霉素菌体5g，共3份，分别用丙酮50ml溶解，超声波条件设定为：功率分别为200、300和400W，单次辐射时间3s，提取时间40min，室温下进行提取。
分别测定灰黄霉素溶液的吸光度，计算提取率。
如Fig.2所示，在超声功率为300W时有最大提取率。
(4)超声波提取时间 称取灰黄霉素菌体5g，用丙酮50ml溶解，超声波条件设定为：功率400W，单次辐射时间3s，间歇时间5s，室温下进行提取。
从提取时间20min开始，每10min取样一次，测定灰黄霉素溶液的吸光度，计算提取率。
如Fig.3所示，在提取时间为40min时有最大提取率。
4 正交实验： 在单一影响因素考察的基础上，确定以10倍量丙酮为提取溶剂，选取超声波功率、单次辐射时间、提取时间作为考察指标，采用四因素三水平L9(34)的正交试验对灰黄霉素的超声波提取工艺进行优化。
根据K值确定灰黄霉素超声波提取的优化工艺条件为：功率300W，单次辐射时间3s，提取时间40min。
根据R值判断，各因素对实验结果的影响大小顺序为BAC。
5 优化工艺的验证实验： 按优化工艺条件重复3次实验进行验证，结果灰黄霉素的收率平均值为85.58%，表明实验所确定的工艺条件为优化工艺条件。
6 超声波循环提取实验： 超声波循环提取器中加入丙酮2200ml(10倍)，开启搅拌转子，调节转速为1000r/min。
缓慢加入菌体220g，待料液完全循环后，开启超声波发射器，按正交实验确定的优化工艺条件(功率300W，单次辐射时间3s，提取时间40min)进行实验，所得提取率为87.65%，略高于验证实验所得提取率。
循环放大实验表明该优化工艺条件可应用于灰黄霉素提取。
三 结论
本研究通过正交设计实验，对灰黄霉素的超声波提取工艺条件进行了优化。
确定了超声波提取灰黄霉素的优化工艺条件为：10倍量的丙酮为提取溶剂，功率300W，单次辐射时间3s，提取时间40min。
验证实验所得提取率为85.58%，超声波循环放大提取实验所得提取率为87.65%，表明了该优化工艺条件应用于灰黄霉素的提取是可行的。
