流式细胞术在临床医学中的应用进展

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流式细胞术在临床医学中的应用进展【1】

【摘要】流式细胞术(FCM)是一种对单细胞快速定量分析的新技术,能够快速分析单个细胞的多种特性，其既可以定性也可以定量，适于大量样品的检测。

随着流式细胞分析技术与方法的日臻完善和临床应用范围不断拓宽，几乎临床医学各学科都涉及到流式细胞分析技术的应用，已逐渐成为推动临床医学发展的重要手段,本文就流式细胞术在临床上的应用进展作一综述。

【关键词】流式细胞术;临床;进展

流式细胞术(flowcytometry,FCM)是20世纪70年代发展起来的对单细胞定量分析的一种新技术。

它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术,具有极高的检测速度与统计精确性,而且从单一细胞可以测得多个参数,为生物医学与临床检验提供了全新视角和强有力手段[1]。

目前,随着单克隆抗体技术的发展,流式细胞仪检测技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各个方面,发挥着重要作用。

本文就其在临床上的应用综述如下。

1 流式细胞术在免疫学中的应用

FCM可以进行淋巴细胞亚群分析,可同时检测出一种或几种淋巴细胞表面亚群分析,将不同的淋巴细胞亚群区分开来,并计算出它们相互间的比例。

通过对患者淋巴细胞各亚群数量的测定了解淋巴细胞的分化功能,鉴别新的淋巴细胞亚群。

更重要的是通过研究大多数疾病的特异性淋巴细胞亚群或某些细胞表面标志的存在、缺乏、过度表达等,对一些疾病,如免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤等诊断、治疗、免疫功能重建和器官移植监测等有重要的临床意义。

如HIV主要侵袭CD4+T细胞而导致CD4淋巴细胞减少,CD4/CD8淋巴细胞比值下降,为艾滋病的诊断和治疗提供依据[2]。

在其它免疫功能性疾病的诊治方面如系统性红斑狼疮(SLE)患者的淋巴细胞变化可反映该病的活动情况和器官侵犯程度,伴有严重肾脏损害的SLE患者可出现低CD4+、高CD8+的现象[3]。

此外,FCM可以用来进行组织相容性抗原(HLA)群体分析;HLA-B27抗原阳性与强直性脊柱炎等一系列关节病有着不同程度的正相关。

FCM应用HLA-B27特异性单抗检测抗原，其敏感性较传统的微量细胞毒性实验大大提高,同时多参数的荧光测定使我们能够在特定的细胞亚群中分析HLA-B27[4-5],还可以利用FCM进行移植配型移植后免疫状态监测。

2 流式细胞术在血液学中的应用

血液系统肿瘤的诊断和治疗 FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析，对白血病、淋巴瘤等各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。

FCM采用各种抗血细胞表面分化抗原的单克隆抗体，借助于各种荧光染料测定一个细胞的多种参数，以正确地判断出该细胞的属性。

各种血细胞系统都具有其独特的抗原，当形态学检查难以区别时，免疫表型参数对各种急性白血病、淋巴瘤的诊断和鉴别诊断有决定性作用，其诊断的准确性可达到90%左右[5]。

微小残留病变(MRD)是白血病复发的主要根源,FCM能在患者缓解期检测是否有残留病变细胞，及早发现后采取措施避免复发。

而且测定 DNA倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗也有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病细胞增殖状况不同，定期了解细胞增殖情况采取相应药物可以提高疗效。

急性白血病的多耐药基因(MDR)也常用FCM检测，FCM特有的敏感性和特异性，用于检测二氨基苯茚酮 mRNA的表达产物 P糖蛋白(Pgp)及其活性(作为药物的排出泵，降低细胞内药物浓度)，可以更直接的反映耐药程度。

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种造血干细胞克隆病,细胞 CD5

5、CD59抗原表达减低是该病的一个特点。

FCM采用荧光标记的单克隆抗体对血细胞 CD59的表达做定量分析，可以协助临床做出诊断并判断疾病的严重程度。

网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标。

FCM通过某些荧光染料(吖啶橙等)与红细胞中 RNA结合，定量测定网织红细胞中 RNA，得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。

有报道认为[6]FCM比目测法的精确度更高。

此外，FCM还可以测量出网织红细胞的成熟度，对红细胞增殖能力的判断很有意义，为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤患者放、化疗对骨髓的抑制状况等提供了依据。

造血干/祖细胞计数造血干/祖细胞具有自我复制和多向分化潜能，是各种血细胞和免疫细胞的始祖。

造血干/祖细胞计数对造血干细胞移植意义重大。

CD34抗原是早期造血干/祖细胞的表面标志，应用 FCM分析、计数 CD34 细胞已成为造血干/祖细胞移植、造血重建的重要指标。

由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白的表达水平的高低来判断,FCM测定血小板膜糖蛋白的表达情况可以诊断血小板膜糖蛋白异常所致疾病,这类疾病很少见但病因明确,主要是GpⅡb/Ⅲa或GpⅠb/Ⅸ/Ⅴ缺陷所致。

患者血小板膜GpⅡb/Ⅲa的缺乏,导致血小板聚集功能明显低下,这就是常染色体隐性遗传病-血小板无力症。

而巨血小板综合征是由于GpⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物数量或质量的缺陷导致的遗传性出血性疾病。

FCM还可以通过单抗免疫荧光标记血小板膜糖蛋白监测血小板功能及活化情况,评价活化血小板程度在血栓性疾病和血栓前状态发生发展中的作用,有利于血栓栓塞性疾病的诊断和治疗,此外血小板活化时细胞内的钙离子浓度是活化血小板监测的一项非免疫性指标,免疫性血小板减少性紫癜患者血浆中可产生血小板自身抗体,结合在血小板表面,称为血小板相关抗体,检测血小板表面或血清中的相关抗体,可用于该病的诊断及治疗监测[7]。

3 流式细胞术在肿瘤学中的应用

FCM在肿瘤学中的应用主要是利用DNA含量测定进行包括癌前病变及早期癌变的检出、化疗指导以及预后评估等工作,FCM可精确定量DNA含量,能对癌前病变的性质和发展趋势做出判断,有助于癌变的早期诊断[6]。

首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液,用荧光染料(碘化吡啶P1)染色后对细胞的DNA含量进行分析,将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G期、S期、G2期),DNA含量直接代表细胞的倍体状态,非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。

DNA非整倍体细胞峰存在可为肿瘤诊断提供有力依据[6]。

肿瘤细胞DNA倍体分析对患者预后的判断亦有重要作用。

异倍体肿瘤恶性病变的复发率、转移率及死亡率均较高,而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。

FCM不仅可以对恶性肿瘤DNA含量进行分析,还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效,了解细胞动力学变化,对肿瘤化疗具有重要的意义。

临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况,依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论,设计最佳治疗方案。

从DNA直方图直接地看到肿瘤细胞的杀伤变化,及时选用有效的药物对肿瘤细胞达到最大的杀伤效果。

4 流式细胞术在细胞凋亡和多药耐药基因中的应用

细胞凋亡是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞死亡的过程,凋亡典型的形态特征是核染色质固缩并分离,细胞质浓缩,细胞膜和核膜皱曲,核断裂形成片断,最后形成数量不等的凋亡小体。

FCM可以进行DNA含量分析,通过二倍体细胞G0/G1期峰前的亚二倍体峰来确定。

在凋亡早期,一些与膜通透性改变及凋亡有关的蛋白在细胞膜表面有特定表达。

通过FCM结合单克隆抗体可以检测表达这些蛋白的细胞,从而确定细胞的凋亡情况。

多重耐药性(multidrugresistance,MDR)是由多药耐药基因编码的P糖蛋白(P-gp)亲脂化合物,包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性排出泵。

从人淋巴细胞排除荧光染料与细胞内P-gp的含量直接相关。

当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时,患者对化疗药物开始出现耐药性,需要考虑其它治疗方式。

多药耐药是肿瘤患者化疗失败的主要原因,FCM对多药耐药基因(如P170)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达的测定,可为临床治疗效果分析提供有力依据[8]。

5 流式细胞术在器官移植中的应用

FCM在器官移植中占有重要地位,可被用来判断供者与受者之间是否合适,用来鉴别和定型同种异体反应抗体[6]。

通过供者白细胞和受者的血清共同孵育,如果受者血清中存在针对供者的循环抗体,就会同供者的淋巴细胞结合,再加入荧光素标记的二抗来显示这种结合,此方法能在移植手术前发现高风险的受体。

移植后免疫表型的监测也很重要。

FCM可用于检测移植后血液或移植内免疫成分的变化,以预防移植后免疫

排斥反应,细胞免疫抑制治疗效果和移植存活情况,可敏感地预测排斥反应的发生,为临床治疗提供有效依据。

6 流式细胞术在临床细菌学中的应用

流式细胞术在临床细菌学中的应用具有快捷、灵敏,能同时进行多参数分析等优点,可广泛用于细菌、病原体、毒素和血清抗体及药敏试验。

免疫荧光检测方法中的流式微球分析(CBA)是FCM的一个新应用。

这种方法也可用于真菌、寄生虫、病毒以及这些病原体的混合感染的检测。

近年来,FCM与荧光染料的联合运用可判断细菌的活力和功能状态,由于速度快,该方法已被建议作为临床实验室的常规药敏试验。

FCM药敏检测方法较多,通过测量加入药物孵育后的散射光的DNA含量来判断抗生素对细菌的敏感性。

该法现被认为是FCM在该领域应用的经典方法[6]。

7 FCM在细胞生物学中的应用

在细胞周期内,DNA含量随时相发生周期性的变化,通过荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定,可分析细胞周期各时相细胞的百分比,周期动力学参数以及DNA异倍体。

可利用与钙离子特异结合的荧光染料和激发光谱或发射光谱是pH值依赖荧光染料进行细胞内钙离子浓度测定和细胞内pH值测定[9]。

8 流式细胞术在优生遗传领域中的应用

流式细胞术可使含量极微的胎儿有核红细胞得到富集,因为有核红细胞含有胎儿的全部基因,并具有不影响多胎妊娠等优点,结合FISH,PCR等技术,使之具有应用于无创性产前诊断的广阔前景[10]。

参考文献

[1] 王建中.临床流式细胞分析.上海：上海科技出版社，2005：8-30.

[2] 邱志峰，王爱霞，陈鸿珊，等.用流式细胞仪检测 HIV感染者和 AIDS患者的T细胞亚群.中华实验和临床病毒学杂志，1999，13(1)：4547.

[3] Osada T，Clay TM，Woo CY，et al.Dendritic cell-based immunotherapy.Iht Rev Immunol，2006，25(5-6)：377413.

[4] Levings MK，Allan S，D Hennezel E，et al.Functional dynamics of naturally occurring regulatory T cells in health and autoimmunity.Adv Immunol，2006，92(12)：119-155.

[5] 徐兵,胡成,缪旭东,等.106例成人急性白血病流式细胞术免疫分型分析.第一军医大学学报,2003,23(10)：1043-1046.

[6] 孙蒂.再谈流式细胞术的广泛应用.中华医学检验杂志,2002,25(1)：61-62.

[7] 王志杰,丛雅琴.流式细胞术检测血小板活化的方法及应用.山东医药,2003,28(43)：64-65.

[8] 孔肇路,金一尊.多药耐药相关蛋白的生物学特性与作用的研究进展.中国癌症杂志,2001,11(4)：375-378.

[9] 耿慧霞,王来,王强.流式细胞仪在生物学中的应用.生物学杂志,2005,11(04)：33-35.

[10] 张锦英,束永前.流式细胞术的工作原理及临床应用.中国生化药物杂志,2003,7(06)：14-16.

流式细胞术在临床检验中的应用【2】

摘要目的：通过了解和讨论，对流式细胞术在临床检验中的应用情况做出详细分析。

方法：通过多次严谨性实验并且真实详细记录每次实验数据，进一步分析流式细胞术在临床检验中的应用效果和可行性。

结果：经过实验数据分析，流式细胞术在检验HLA-B27抗原、淋巴细胞亚群、肿瘤标志物、白血病免疫、临床微生物等应用中有着明显的效果。

结论：流式细胞术在临床检验中可以得到很好的应用。

关键词流式细胞术;流式细胞仪;临床检验;应用

流式细胞术是一种生物学技术，用流式细胞仪(FACS)对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。

这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。

流式细胞术(FCM)是对悬液中的单细胞或其他生物粒子，通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。

FCM不但快速、灵敏而且还可以同时对多个参数进行分析，FCM在临床微生物检测中的作用受到越来越多人的关注。

FCM不但可以用来检测受染细胞内的病毒抗原，而且还可以对受染细胞表面的病毒抗原进行检测。

由于FCM检测的一般只是单个细胞，因此经过FCM检测的受染细胞只适用于支气管灌洗液、血液、尿标本以及一些经酶消化过的组织细胞，同时由于FCM进行的是多参数分析。

所以FCM体外抗生素药敏试验的主要机制是，通过FCM检测病原体和染料结合在一起后所发出的不同强度的荧光。

从而间接地反映出病原体的功能状态以及活性，以达到帮助判断病原体对抗生素的反应性目的，其中用于研究抗菌效应的荧光染料主要有2大类：其中用来标记DNA和RNA的染料主要包括如溴化乙锭、碘化丙啶等;其次是用来反映代谢活性或结合蛋白的探针，其中包括异硫氰酸荧光素、膜电位敏感性染料等。

怎样选择这些物质，与这种染料本身的发射特性有关，同时抗生素的作用机制也可能关系到这些物质的选择。

近年来FCM在细菌的药敏效应的研究领域已获成功，将这些荧光染料和FCM联合运用到一起，可以判断其细菌活力与功能状态，这种方法由于有速度快等优势，临床实验室的常规药敏试验中也应用到这种方法。

方法

本实验用到的细胞定量分析和分选技术，这个技术要用的实验细胞包括MCF

7、293(T)、U20S等。

以U20S细胞为例，他们通常所用的操作方法：首先对细胞进行培养以及铺板，转染、细胞分板、上机样本制备、加药刺激、细胞收获及处理、相关试剂配制等步骤。

其中在细胞培养时，以U20S细胞作为细胞株和材料，在这个过程我们要注意的是一瓶细胞总数一般情况下会达到1107个。

在铺板的过程首先要对细胞进行分化，然后才对细胞进行计数，计数时如果发现细胞密度很大，影响计数，就必须对细胞进行合适倍数的稀释后才计数。

最后才能进行铺板。

铺板的过程是：首先在6cm培养皿按照每孔6105个的数量加入细胞，然后将6cm培养皿沿水平面方向前后左右来回晃动，使细胞能够均匀分布，晃动时要小心以防止培养液泼出，再将细胞放置培养箱里生长。

将这些过程都完成后，然后可以用转染色剂Lipofectamin2000进行转染操作，其操作过程：首先在DEF-FN载体上构建目的基因质粒，当细胞密度为达到50%～60%时，再进行转染操作，转染12～16h后，再根据细胞密度按1：3进行分板，使分板后细胞密度30%左右。

除了以转染质粒作为阳性对照外，我们还可以以药物处理细胞作为阳性对照。

将细胞铺板24h后，再加药对其进行刺激，加药培养24h后，然后就可以对细胞进行收获处理了。

注意在这个过程中要分别对培养液进行收集，在每个6cm规格的板中加入1mL胰酶进行消化。

待消化完毕后，再向内一一对应地加入已收集的培养液来中和胰酶。

上述过程进行完之后，最少要放置4h，才能从将细胞样本从冰箱里取出进行离心操作来收集细胞。

将1PBS清洗2遍后，再加入100L 1PBS将两者混匀，加入10L PI(终浓度100g/mL)，10LRnase(终浓度50g/mL)，置于37℃水浴锅，避光处理30min。

这样才算完成上机样本制备。

在处理分选细胞样本前，要对细胞进行贴壁培养，每个细胞样本至少需要1个10cm规格的细胞板，去除培养液酶消化，在37℃条件下充分消化至细胞轻拍脱壁，再加入5mL培养液进行中和，以充分分散细胞，取100L细胞上机，测定转染效率，剩余细胞计数、离心，根据转染效率，分选模式，调节细胞浓度，达到上样速率1000～3000个/s。

结果

经过实验分析得出结果，将其用于病毒检测具有以下优点及可行性：可在单个细胞中同时获得多个分析参数;能定量检出受染细胞，当用不同荧光染料标记不同的病毒抗原特异性抗体或将特异性病毒抗体与不同大小的乳胶颗粒相联时，FCM可同时检测到同一样本中的多种病毒或病毒抗原，这种方法也可用于真菌、寄生虫、病毒以及这些病原体混合感染的检测。

讨论

随着科学技术的发展，流式细胞技术也取得了快速的发展，其临床应用越来越广泛，在临床工作中发挥着重要的作用。

流式细胞术已普遍应用于免疫学、细胞生物学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。

随着对FCM研究的日益深入，其价值已经从科学研究走人了临床应用阶段，在我国临床医学领域里已有着广泛的应用。

可见流式细胞术在临床检验的应用具有很好的发展前景和可靠性。