如何建立高效液相色谱法测定含量的方法

[高效液相层析的方法]⑴液-固吸附层析：固定相是具有吸附活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺凝胶等。液-固吸附层析中的流动相依其所起的作用不同，分为“底剂”和洗脱剂两类，底...+阅读

1 色谱条件的确定专属性是色谱条件建立的关键ز通常是采用在被测物对照品（或供试品）中加入适量的杂质或辅料ز以验证所选色谱条件能否将各杂质与被测物分离检出[2]。应按1ر（w/w）被测物浓度的各杂质量添加至被测物中ز模拟被测物中可能存在杂质的状态ز即有少量（约1ر）杂质存在时能否与被测物达到完全分离（分离度大于1.5）ز以验证系统适用性。

只有这样才能较为客观、科学地反映被测物的实际情况。而不应将被测物与各杂质配制成相同浓度的溶液ز因为实际检测中不可能存在这种情况ز且该浓度也不易确定。在实际检测时ز由于被测物浓度较大ز很易将相邻杂质峰包含其中。另外还需测定溶剂和辅料（检测制剂时）是否有干扰。目前ز美国药典（USP）、英国药典（BP）及许多进口产品的质量标准中ز有关物质测定方法学的专属性验证均采用此法。

还须说明的是س杂质与杂质峰间的分离度达1.2即可ز而被测物与其相邻杂质峰的分离度必须大于1.5。2 检测波长的选择有关物质检测的研究对象是杂质ز而非被测物。但测定则是通过各自的峰面积来表达ز故波长的选择必须考虑被测物和各杂质在检测波长下的校正因子（f）是否相同。应分别制备相同浓度的被测物与各杂质溶液ز经紫外扫描后以吸光度相近的波长为检测波长。

在该检测波长下ز分别进样测定ز由各峰面积计算校正因子。若f为0.8ص1.2ز则表明被测物与各杂质的f相同ز可消除f的影响。若f≤0.8或f ≥1.2ز则应在计算时加入f。目前通常以被测物的最大吸收波长为检测波长、不加校正因子的计算方法ز而未综合考虑各杂质的f。3 供试品溶液浓度的确定供试品溶液浓度的确定也非常重要。虽然浓度越高越能反映被测物中杂质存在的情况ز但若设定过高ز会产生主峰严重拖尾、裂峰、柱超载和检测器超载等情况ش若设定过低ز则灵敏度不够ز无法检测杂质及其含量变化。

最低检出浓度的测定可分为信噪比法和直接评价法两种[3]。后法是目前较为科学的做法ز即将仪器的灵敏度调至较适宜的值（仅对灵敏度可调节的仪器而言ز目前市场上主流品牌的液相色谱仪均已设定了一个恒定、较为灵敏的值）ز然后将被测物溶液不断稀释后进样测定ز直至被测物峰面积无法检出为止ز此时的浓度即为最低检出浓度。最大进样量则是采用不断增加被测物溶液浓度ز直至峰严重拖尾、裂峰、柱超载和检测器超载等情况出现。

根据最低检出浓度ز采用“上推法”来确定供试品溶液浓度س如一般设定杂质总量小于1.0ر对照液ز对照溶液的浓度至少应为最低检出浓度的20ص50倍ز供试品溶液浓度则应是最低检出浓度的2000ص5000倍。同时还应考虑仪器、色谱柱等因素对最低检出浓度和最大进样浓度的影响（即耐用性因素）ز所以供试品溶液的浓度应在保证小于最大进样量的情况下ز适当设定得高些ز以保证该浓度在任何试验条件下ز均有足够的检测灵敏度。

表1为最低检出浓度、最大进样量、供试品溶液和对照溶液间的比例关系（进样量10µlز规定杂质限度1.0ر）。4 线性试验在稳定性考察中ز如某杂质含量不断增加ز则说明被测物降解的途径稳定、可循ز则有必要对该杂质进行针对性地监控ز即采用该杂质对照品（经确证结构后ز由人工合成获得）以外标法准确测定。此时ز与含量测定相似ز应进行线性试验。

通常将杂质限度设定为该杂质的100ر浓度ز线性验证范围10رص150ر（即相当于被测物测定浓度表1 最低检出量、最大进样量、供试品溶液和对照溶液间的比例关系参数浓度/µg·ml–1绝对量/ng相当于供试品溶液浓度/ر与最低检出浓度的倍数最大进样量3000最低检出浓度0.110.02供