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【摘要】 目的 建立高效液相色谱法测定白花蛇舌草中槲皮素含量的方法。方法 采用Hypersil BDS C18色谱柱(4.6 mm200 mm,5 m),流动相为甲醇?水?磷酸(体积比50∶50∶0.2) ,检测波长为370 nm。结果 槲皮素在0.08~ 0.32 g 的范围内与峰面积呈良好线性关系(r=0.999 6),平均加样回收率为101.5%,RSD为0.8%(n=6)。结论 本法快速、简便、准确,可用于测定白花蛇舌草中槲皮素的含量,为评价白花蛇舌草的内在质量提供科学依据。
【关键词】 白花蛇舌草 槲皮素 含量测定 高效液相色谱法
白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd.)的干燥全草,研究表明该植物主要含有黄酮类、三萜类、蒽醌类、环烯醚苷萜类、甾醇类、烷烃类等化学成分,具有抗肝炎、抗肿瘤、抗病毒、抗炎抑菌、降血脂及降血糖等多种药理活性[1]。白花蛇舌草中黄酮类化合物的含量测定未见文献报导,本文采用HPLC法测定了白花蛇舌草中槲皮素的含量,为评价白花蛇舌草的内在质量提供科学依据。
1 仪器与药品
高效液相色谱仪:P230高压恒流泵/DAD230二极管阵列检测器(大连依利特分析仪器有限公司),Hypersil BDS C18色谱柱(4.6 mm200 mm,5m,大连依利特分析仪器有限公司);电子精密天平(Ohaus);KS?1500超声清洗器(宁波科胜仪器厂);高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。
白花蛇舌草(市售,批号2006001,2006002,2006003),经本校药植教研室陈再兴老师鉴定均为白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd.);槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所,批号100081-200406,供含量测定用);甲醇为色谱纯;水为重蒸水。
2 结果与分析
2.1 色谱条件
色谱柱:Hypersil BDS C18色谱柱(4.6 mm200 mm,5 m),流动相:甲醇?水?磷酸(体积比50∶50∶0.2);检测波长:370 nm,流速:1 mL/min,柱温:25 ℃ ,进样量:20 L。色谱图见图
1、2。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素对照品适量,加甲醇制成每1 mL含槲皮素10 g的溶液,即得。
2.3 样品溶液的制备
取白花蛇舌草药材粗粉1.0 g,精密称定,置烧瓶中,精密加入50%(体积分数)甲醇20 mL和盐酸1 mL,密塞,称定重量,加热回流2 h,放冷,用50%(体积分数)甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液5 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜 (0.45 m) 滤过,取续滤液,即得。
2.4 系统适用性试验
分别取对照品溶液、供试品溶液各20 L进样测定,理论塔板数为15 000,供试品溶液色谱图中槲皮素峰与相邻杂质峰的分离度大于1.5。
2.5 线性关系的考察
精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素对照品10.0 mg,加甲醇定容至100 mL,分别精密量取上述对照品溶液0.
4、0.
6、0.
8、1.0、1.
2、1.
4、1.6 mL 置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制成系列浓度的溶液。分别精密吸取各溶液20 L,注入液相色谱仪,记录色谱图。以槲皮素峰面积(A)为纵坐标,槲皮素进样量(m)为横坐标,绘制准曲线,得回归方程为A=274.79m+54.43,r=0.999 6,结果表明槲皮素在0.08~0.32 g范围内与峰面积成良好线性关系。
2.6 精密度试验
取槲皮素对照品溶液20 L ,重复进样6次分别测定峰面积为2 949,2 911,2 891,2 946,2 950,2 957, RSD为0.9%(n=6),结果表明精密度良好。
2.7 稳定性试验
取供试品溶液(批号2006001),分别在
2、
4、
6、
8、
10、12 h进样,测得槲皮素峰面积为1 437,1 422,1 451,1 430,1 421,1 425,RSD为0.8%,结果表明供试样品溶液在12 h内稳定。
2.8 重现性试验
取同一批号的白花蛇舌草5份,按2.3制备样品溶液,进行测定,测得槲皮素的峰面积为1 447,1 452,1 425,1 419,1 423,RSD为1.1%(n=5),结果表明该方法重现性良好。
2.9 回收率试验
精密称取已知含量的白花蛇舌草(批号2006001)5份,分别加入槲皮素对照品适量,按2.3制备供试品溶液,测定含量,结果测得回收率101.8%,102.4%,101.9%,101.1%,100.4%,平均值为101.5%;RSD为0.8%。
2.10 样品测定
分别取白花蛇舌草药材3批(批号2006001,2006002,2006003),按2.3制备供试品溶液,进样测定,结果测得槲皮素质量分数分别为:0.091 3,0.085 7和0.088 0 mg/g。
3 讨 论
3.1 文献报道槲皮素的检测波长为360nm[2,3]、254 nm[4] 、368 nm[5],本文利用DAD二极管阵列检测器对槲皮素对照品进行全波长扫描,结果最大吸收峰为370.2 nm,故选择370 nm为检测波长,见图3。
3.2 实验考察了不同比例的甲醇?水为流动相,最后确定流动相为甲醇?水?磷酸(体积比50∶50∶0.2),柱温25 ℃,流速1 mL/min,样品中槲皮素达到良好的分离。
3.3 白花蛇舌草中黄酮类化合物的含量测定未见文献报导,本文采用高效液相色谱法测定了白花蛇舌草药材中槲皮素的含量,操作简便、快速,可作为白花蛇舌草质量控制的有效手段。
【参考文献】
[1] 郑宏钧,詹亚华.现代中药材鉴别手册[M].北京:中国医药科技出版社,2001:798.
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[4] 卢文彪,曾元儿.HPLC法测定紫花杜鹃胶囊中槲皮素的含量[J].湖南中医药导报,2002,8(3):133-134.
[5] 杨龙辉,伍丕娥,王天志.HPLC测定沙棘膏中槲皮素和异鼠李素的含量[J].华西药学杂志,2002,17(2):130.
高效液相色谱法测定白花蛇舌草中槲皮素的含量