ATP生物发光技术在食品工程中的应用研究

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摘要：作为一种快速检测微生物的新兴技术，ATP生物发光法具有灵敏度高、快捷的特点，被广泛应用于食品工业中。本文分析了ATP的发光原理与特点，并探究了其在食品工程中的具体应用。

关键词：ATP生物发光法应用食品

引言

在食品生产、销售以及存储等过程中，均需要通过微生物检验来严格控制食品质量，这是食品行业的重要管理内容。关于微生物快速检验的方法较多，如酶联免疫法、PCR技术等。这些检测技术大多采用琼脂平板进行微生物培养，可靠程度较高。但采用这种微生物培养方式，存在耗时较长的缺陷，一般需要培养两至三天，因此检验结果也相对滞后。在食品安全与卫生监测工作中，要想解决检验结果滞后的问题，就需要找到更加便捷、准确地检验食品质量的方法。而ATP生物发光法的灵敏度高，且操作简便，因此被广泛应用于食品工业中。

一、ATP的生物发光原理与特点

1.1 ATP的生物发光原理

ATP在所有活体生物中均可提取出来，主要发挥着在生物体中传递化学能并存储的作用。若生物体凋亡，则ATP在细胞内各种酶的作用下会很快被分解。因此，对生物体中的ATP浓度进行测定，就可以估算出活体细胞数目。ATP具备生物发光的机理，最早发现于1949年。Moyer等于1983年提出ATP可以反映活体细胞数量以及生物活性[1]。ATP能够通过生物发光实验发光，依赖于试剂中的萤火虫荧光素酶。荧光素酶在镁离子的作用下，可以与ATP发生反应，之后活化的荧光素酶能够结合荧光素，产生相应的荧光素复合体，并释放出光量子。这些复合体在氢氧化后可以生成发射光，最终产生氧化虫荧光素。研究表明[2]，荧光素酶的适宜酸碱度在7.5左右，并且可以和作用底物ATP反应，而ATP具有呈现S形的酶促动力学。荧光素酶的反应速率与底物浓度有一定的关系，即ATP浓度越高反应速率就越快，同时在检测过程中也可以获得更高的荧光素强度。在ATP保持较低浓度范围时，其与荧光素酶的反应速度呈现一级关系。而活体微生物在某个生物期内，其ATP的含量是较为稳定的，这样就可以绘制出生物体中ATP的线性图。微生物死亡后其中的ATP迅速被分解，不会影响到活体细胞数目的测定。由于ATP具备这样的特性，因此在活体微生物测量中应用较为广泛。

1.2 ATP的生物发光特点

ATP生物发光法的操作较为简便，且测量灵敏度高，能够实现实时测量。在食品工程中对微生物进行检验时，要求样品中微生物的浓度在每毫升1000以上，以保证测量准确度符合卫生学的标准。研究表明，在ATP浓度较低的情况下，荧光素复合体可以与超过90%的大肠杆菌结合，而普通颗粒所能结合的数目只有50%左右。该方法的最低检测限为每毫升20cfu，作用时间只需要1小时，比其它方法相比时间更短，灵敏度更高。例如采用体荧光技术，对原奶中的大肠杆菌检测，全过程所需时间约为10小时。而采用酶联免疫法进行大肠杆菌监测，检测限为每毫升1105 cfu-1106 cfu/ml，所需时间为1.5小时。但采用这种检测方法，很难将非微生物与微生物ATP区分开来，而ATP样品、食品中均含有各种离子，这些离子会对检验过程带来一定的干扰，对荧光素酶的发光作用也可能有抑制。

二、ATP在食品工程中的应用范围

2.1 在食品微生物检测中的应用

在食品行业中ATP生物发光技术的应用领域较多，主要是通过测定食品中微生物的含量，进而对食品质量进行判定。例如，采用这种方法可以对肉制品中的微生物进行测定，进而了解细菌污染的程度。与常规的细菌菌落培养法相比，采用ATP生物发光技术的灵敏度更高，但两者也存在相关性。在乳制品中采用这种测定方法，可以快速测定乳酸菌的水平。此外，在各种调味品、啤酒等微生物测定中，ATP发光法也有重要应用。研究表明[3]，采用常规琼脂平板细菌培养法与ATP发光法也有一定的相关度。此外，可以采用对ATP生物发光法进行优化，进而对面粉中的微生物含量进行测定。通过优化后，设定荧光素酶为50mg/L，荧光素为70mg/L，镁离子为0.25mol/L。生肉类食品由于体细胞ATP对结果的干扰较大，因此需要清除掉样品中体细胞ATP，其采用的方法是首先用0.2%的TritonX-100 和0.15%的apyrase混合液清除体细胞ATP，然后加入3%的三氯乙酸混合并振摇1min，离心后取上清检测ATP，该光值即为细菌ATP发光值，整个过程需15min。而熟肉类中非细菌ATP含量低，对结果影响较小可以省略清除体细胞ATP步骤而直接测定，整个过程需4min。经过38份样品实验对比，ATP生物发光法检测结果与细菌菌落平板计数方法之间具有良好的线性关系(r=0.98)[4]。

2.2 在食品生产环境清洁度方面的应用

在食品生产与销售的整个过程中，均需要分析各种影响食品安全的因素，并对该过程的重点环节进行有效控制，且依据相应的卫生管理标准进行管理。在对食品安全进行监测与管理过程中，需要做好各类食品的微生物监测工作，对各类食品的生产与流通环境进行监测，保障其有较高的清洁度，准确记录各类监测数据，以降低食品安全事故的发生率。对于食品生产环境清洁度的测定，常规的方法就是平板细菌培养与取样法，通过培养微生物来测定食品表面微生物的含量。但是这种传统的细菌测定方式周期较长，测定的结果相对滞后，缺乏实用性，无法满足食品工程中对环境清洁度的管理要求。

在食品生产安全监测工作中，食品残渣可以看做最为主要的污染源，而各类食品中均可提取出耐热性高的ATP。因此，通过ATP生物发光技术，可以对食品生产与流通过程中的环境清洁度进行快速测定，进而保障食品生产满足相应的卫生标准。例如，在食品加工过程中，采用ATP测定法可以对生产线、操作台等部位的微生物进行快速测定，进而明确这些部位的清洁度。首先在选定测试区域内，滴加2滴ATP 释放液，用无菌棉拭子均匀涂抹测试样品，采样面积为100cm2;然后在棉拭子头部滴加6滴ATP释放液，提取ATP;最后立即将拭子头部ATP提取液点在检测膜上，用ATP荧光仪测定生物发光值(RLU)，同时采用国标法检测大肠菌群和细菌总数。其中规定大肠菌群阳性为不合格，细菌总数以大于500cfu/100cm2 为不合格，ATP 生物发光法以RLU大于600为不合格。在282份样品中，3种检验方法所测出不合格样本的阳性率分别为23.4 %、25.5 %、9.4 %。ATP生物发光法的阳性率与大肠菌群和细菌总数的阳性率没有显著性差异(P0.05)[6]。此外，对于食品存储场所，如食品盛放器皿、冰箱等也可以测定微生物水平。研究表明[5]，采用这种方法进行清洁度测定，与常规的琼脂平板法具有相似性，且操作性更强。我们也可以将酵母菌毒素测定与这种方法联合使用，以此更好地为食品安全监测服务。目前，ATP发光技术与其它食品安全检测技术联用的较多，如与酶联免疫法、PNA探针的联合使用等。

2.3 在RMDS系统中的应用

RMDS系统由ATP发光反应装置、过滤膜、数据处理以及荧光增强装置等构成。待测样品在经过过滤膜后，需要经过一段时间的膜温培养，然后将其从培养皿上分离，在烘干后加入ATP提取剂，之后将荧光素酶喷洒在烘干的膜上。通过RMDS系统可以发现每一个微生物菌落产生的光斑，而通过荧光增强系统可以增强荧光，并获取相应的荧光图像。在系统数据处理装置中可以对这些图像进行处理与存档，进而获取相应的数据用于计量微生物数量。

三、结语

ATP生物发光技术具有独特的微生物检测优势，而其与其它检测技术的应用将提高检测效率，是食品流通与环境监测中测定微生物的有效方法。相信随着ATP技术的不断完善与成熟，其在食品、环境监测、医药等领域将有更为广泛的应用。

参考文献：

[1]伍季，王燕，章建军，章银良.ATP生物发光法快速检测啤酒中的菌落总数[J].河南科学，2012(11).

[2]卿柳庭，屈小玲.核酸探针和PCR技术在食品检验中的应用[J].动物医学进展，2014(11).

[3]张永祥，辛锡龙.PCR技术在致病菌检测中的应用[J].中国国境卫生检疫杂志，2011(10).

ATP生物发光技术在食品工程中的应用研究