大鼠弥漫性脑损伤后早期cfos基因表达的法医学研究

[mtDNA异质性及其法医学应用]【关键词】mtdna；异质性【中图分类号】d919．2 【文献标识码】b 【文章编号】1007—9297(2006)02—0140—04 线粒体dna(mitochondrial dna，mtdna)是惟一的细胞核外dna。人类mt...+阅读

【摘要】目的观察大鼠弥漫性脑损伤后c—f0s基因表达的规律。方法采用marmarou的弥漫性脑损伤模型，分

别于伤后15 min，30min，lh，3h，6h，12h，24h取脑组织，运用免疫组化sabc法观察c—fos基因的表达。结果打击后15 min

时，即可观察到c—fos基因的表达，1 h后表达明显增加

，3 h达到高峰，随着损伤时间的延长，阳性反应细胞逐渐减少，24 h

可见少量表达。表达呈弥漫性，以皮层、脑干最为明显，不同部位的变化趋势一致。对照组未见阳性反应细胞结论c—

fos基因的表达规律可用于弥漫性脑损伤的早期鉴定及损伤经过时间的推断

【关键词】弥漫性脑损伤；c—fos基因；免疫组织化学；嗜银染色；损伤经过时间

【中图分类号】r36

【文献标识码】a

【文章编号】1007—9297(2005)01—0042—03

study on the expression of c-fos gene in the early stage of difuse brain injury in rats and its forensic implication．

chen ren—hui，l1 yo ’ ong，cheng li—bao．department offorensic pathology，wannan medical college， u 241001

【abstract】0bjective to investigate the expression of c—fos gene in diffuse brain injury(dbi)．methods based on

marmarou s model of dbi and took the samples at 15min，30min，lh，3h，6h，12h，24h after brain injury．the expression of c—f0s

gene was observed by immunohistochemical sabc． results rhe expression of c-fos gene could be detected at 15min after

injury，increased at lh and peaked at 3h．positive cells decreased with the prolongation of injury time．little expression was

f0und at 24h． i’he expression of c—fos gene was f0und in wide range but significant in cortex and brain stem． i’he chan ging

tendency of diferent areas was same． rhe control group showed negative staining． conclusion rhe c-fos gene can diagn ose

and date early dbi．

【key words】difuse brain injury；c—fos gene；immunohistochemistry；silver staining；injury time

脑损伤是法医学鉴定中最常见的损伤，弥漫性脑

损伤(diffuse brain injury．dbi)作为闭合性脑损伤的一

种，多见于交通事故。c—fos基因属于即刻早基因家族

(immediate early gene，iegs)，在正常情况下参与神经

细胞的生长、发育、分化、记忆和信息传递过程，生理

情况下不易被检测到。当神经组织受到病理性刺激如

脑缺血、外伤等作用后，c—fos基因快速表达，02] 因

此被称为快速反应原癌基因。c—fos基因表达是神经

组织受伤害的早期指标。目前有关dbi后c—fos基因

表达的文献很少，作者拟采用marmarou的弥漫性脑

损伤模型．『31初步探讨大鼠dbi后c—fos基因表达的

规律。

材料与方法

一

、试验动物

健康雄性sd大鼠48只f南京青龙山实验动物中

心提供)，体重300～320 g，随机分成dbi 15min、30

min，1 h，3 h，6h，12h，24h组及及对照组，共8组。每

组6只大鼠

二、模型制作

采用marmarou脑损伤模型，用1％戊巴比妥 12全文查看钠腹

腔注射(30 mg／kg)，麻醉成功后，大鼠头部做中线切

口，暴露颅骨．将直径10 mm、厚3 mm的打击垫片用

高分子聚脂固定于颅顶的冠状缝与人字缝之间的中央

部．然后将大鼠俯卧固定已知厚度及弹性系数的海绵

床上，待动物开始苏醒、有肢体活动时，移至一有机塑

料管下端．垫片正对管中央。450g铁

棒从2m高度自

管内自由坠落至打击垫片上．立即移开海绵床以免二

次损伤。

三、组织处理及切片

在设定的时间内处死动物：将动物过量麻醉后，

断头取脑．打开颅骨后迅速用4％多聚甲醛液预固定：

【作者简介】陈仁辉(1979一)，男，安徽宁国人，硕士，主要从事闭合性颅脑损伤的研究。

联系方式：+86—1 3855347401： e—mail：wnmccrh#hotmail．corn

法律与医学杂志2005年第12卷(第1期)

取大鼠全脑于4％多聚甲醛液后固定12h．沿大脑

正中裂矢状切开大脑、小脑、脑干，于正中切面左有外

侧3 mm处切取左有大脑皮质、脑以及脑干组织各

l块，分别做常规石蜡包埋，切片厚5 m。分别作he

染色、嗜银染色及c—fos免疫组织化学染色

四、试剂及方法

rabbit anti—c—fos：dab显色试剂盒及sabc

试剂盒(武汉博士德公司)，按说明书进行操作。』f】

pbs取代一抗、二抗作阴性对照，以细胞核fi{现黄色

产物为阳性结果。硝酸银、氯化金、硫代硫酸钠、饱和

氨水，按glees—marslands染色法进行

五、图像分析及统计学处理

高倍视野fx400)下分别对大脑皮质、丘脑以及脑

干随机选取5个视野．依次计数每个视野内阳性细胞

数，以其平均值作为该切片层面的阳性细胞数，以同

一动物6个切片层面的平均阳性细胞数作为该动物

的阳性细胞数各组动物再分别计算其组内阳性细胞

数。实验数据采用spss 10．0统计软件进行方差分析、

检验。

结果

一

、大体及镜下观察

实验组可见蛛网膜下腔出血，脑表面基本正常，

无大面积挫伤或局灶性挫裂伤灶。少数动物可见脑干

有灶性出血、侧脑室出血。未见脑组织局灶性病灶。镜

下可见神经元胞体明显肿胀，结构不清．核固缩，胞浆

红染加深．神经元损害主要分布于两侧大脑皮质。胶

质细胞肿胀明显。细胞周围间质水肿。嗜银染色示轴

索变粗、肿胀，呈串珠状、波浪状或螺旋状改变(图1)．

可见轴索断端膨大呈球形改变。

二、免疫组织化学染色

dbi后15min．即可观察到阳性反应细胞．呈散存

少量分布f图2)。阳性产物呈棕黄色，主要位于胞核

内，胞浆内以及大的突起根部也有表达。1 h后表达明

显增加(图3)，并于3 h达到高峰(图4)。随着损伤时间

延长，阳性反应细胞逐渐减少．24h后可见少量表达。

表达呈弥漫性．以皮层、脑干最为明显，不同部位的变

化趋势一致阳性反应细胞包括神经元及各类胶质细

胞 c—los基因表达的阳性细胞数，见表l 正常对照组

大脑皮质、丘脑以及脑干未见阳性反应细胞。

讨论

弥漫性脑损伤(diffuse brain injury dbi)是一类常

见的、后果严重的原发性脑损伤，具有较高的致残率

· 43 ·

和病死率，在法医学中较常见。一般认为dbi主要包

括弥漫性轴索损伤、弥漫性脑肿胀、缺氧性脑损害、弥

漫性血管损伤等4种基本类型。[51 4种病理变化常可

同时存在。本实验采用marmarou的模型制作方法．在

镜下可以观察到神经元肿胀，结构不清，核固缩改变。

细胞间质水肿明显。轴索增粗、肿胀，断端可见轴索球

形成等。符合dbi的病理学改变，并且随着损伤时间

的延长，上述病理学改变逐渐加重

原癌基因c—los是fbj和fbr小鼠特发性骨肉

瘤(msv)中病毒癌基因v—los的细胞同源物。c—los原

癌基[大j高度保守，小鼠、大鼠与人的los同源性分别为

97％和94％。人类的c—los基因定位于第14号染色体

(14q)．[61由3．5kb的dna片段组成，当c—los基因被

激活后迅速转录mrna，然后进入胞质．在胞质中合

成c—fos蛋白．之后较快地进入胞核，称为核磷酸蛋

白，它由380个氨基酸组成．其分子量为55kb，是

dna结合蛋白

c—fos基因为神经系统最常见的即刻早基因．在

外界刺激下数十分钟内c—fos基因即开始表达，其表

达产物c—fos蛋白与c—iun基因的表达产物c—iun蛋

白通过“亮氨酸拉链”形成f0s-jun异源二聚体．构成

ap一1转录因子，进一步激活目的基因的表达。[7】c—fos

基因的表达在创伤的初始应答与继发性病理生理改

变之间可能成为重要的中介．f8如参与了细胞内外信

号传导、细胞凋亡及继发性颅脑损伤等。

本文应用marmarou的弥漫性脑损伤模型研究了

c—los基因的表达情况。实验显示，打击后15 min，脑

皮层、脑干等部位中即出现c—los基因的表达，1 h后

表达明显增加，3 h达到高峰，整个鼠脑组织中，包括

脑皮层、皮层下、丘脑、脑干等区域均呈弥漫性表达，

不同部位的变化趋势一致，而后逐渐下降，24h后仍

可见少量表达。

关于脑创伤后c—los基因的表达机制据认为是通

过谷氨酸n一甲基一d一天门冬氨酸受体(nmdar)介导

的并随着谷氨酸释放增多而上升。i 9i谷氨酸的释放激

活神经细胞膜nmda受体，使受体活化而介导c—los

基因的表达另一种观点认为神经元中c—los基因的

表达是由leao播散性抑制(spreading depression

sd)所致。㈣机械性损伤可以诱发sd，sd可将细胞外

ca 转移至细胞内，造成细胞外caz 浓度下降，引起皮

层神经元去极化。ca 内流及神经元去极化均可引起

c—los基因的表达。

本实验通过成功复制dbi动物模型．运用he、神

经纤维特殊染色以及免疫组化技术，不仅说明dbi存

在复杂的病理学改变．同时c—los 固表选的即时性

1技f『j问上的相对规律性．也为我们早期鉴定dbi手u推

断其掘协彝过时间提供了参考，、

}女

i1】man s．gr 目#mg the regulation i ful：li-in ui d

．thor【e(：s in i ⋯ ⋯ vmmui neon 1990 4( ，7 s7

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法律医学杂 2005年第l2卷f第1期)

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7 k．mu璐．x⋯ jj m incm~cd ⋯of bⅲrn^

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别于伤后15 min，30min，lh，3h，6h，12h，24h取脑组织，运用免疫组化sbc法观察c—fos基因的表达。结果打击后15 min

时，即可观察到c—fos基因的表达，1 h后表达明显增加

，3 h达到高峰，随着损伤时间的延长，阳性反应细胞逐渐减少，24 h

可见少量表达。表达呈弥漫性，以皮层、脑干最为明显，不同部位的变化趋势一致。对照组未见阳性反应细胞结论c—

fos基因的表达规律可用于弥漫性脑损伤的早期鉴定及损伤经过时间的推断

【关键词】弥漫性脑损伤；c—fos基因；免疫组织化学；嗜银染色；损伤经过时间

【中图分类号】r36

【文献标识码】

【文章编号】1007—9297(2005)01—0042—03

sudy on h prssion of c-fos n in h rly s of difus brin injury in rs nd is fornsic implicion．

chn rn—hui，l1 yo ’ on，chn li—bo．dprmn offornsic pholoy，wnnn mdicl coll， u 241001

【bsrc】0bjciv o invsi h prssion of c—fos n in diffus brin injury(dbi)．mhods bsd on

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【ky words】difus brin injury；c—fos n；immunohisochmisry；silvr sinin；injury im

脑损伤是法医学鉴定中最常见的损伤，弥漫性脑

损伤(diffus brin injury．dbi)作为闭合性脑损伤的一

种，多见于交通事故。c—fos基因属于即刻早基因家族

(immdi rly n，is)，在正常情况下参与神经

细胞的生长、发育、分化、记忆和信息传递过程，生理

情况下不易被检测到。当神经组织受到病理性刺激如

脑缺血、外伤等作用后，c—fos基因快速表达，02] 因

此被称为快速反应原癌基因。c—fos基因表达是神经

组织受伤害的早期指标。目前有关dbi后c—fos基因

表达的文献很少，作者拟采用mrmrou的弥漫性脑

损伤模型．『31初步探讨大鼠dbi后c—fos基因表达的

规律。

材料与方法

一

、试验动物

健康雄性sd大鼠48只f南京青龙山实验动物中

心提供)，体重300～320 ，随机分成dbi 15min、30

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组6只大鼠

二、模型制作

采用mrmrou脑损伤模型，用1％戊巴比妥[]钠腹

腔注射(30 m／k)，麻醉成功后，大鼠头部做中线切

口，暴露颅骨．将直径10 mm、厚3 mm的打击垫片用

高分子聚脂固定于颅顶的冠状缝与人字缝之间的中央

部．然后将大鼠俯卧固定已知厚度及弹性系数的海绵

床上，待动物开始苏醒、有肢体活动时，移至一有机塑

料管下端．垫片正对管中央。450铁

棒从2m高度自

管内自由坠落至打击垫片上．立即移开海绵床以免二

次损伤。

三、组织处理及切片

在设定的时间内处死动物：将动物过量麻醉后，

断头取脑．打开颅骨后迅速用4％多聚甲醛液预固定：

【作者简介】陈仁辉(1979一)，男，安徽宁国人，硕士，主要从事闭合性颅脑损伤的研究。

联系方式：+86—1 3855347401： —mil：wnmccrh#homil．corn

法律与医学杂志2005年第12卷(第1期)

取大鼠全脑于4％多聚甲醛液后固定12h．沿大脑

正中裂矢状切开大脑、小脑、脑干，于正中切面左有外

侧3 mm处切取左有大脑皮质、脑以及脑干组织各

l块，分别做常规石蜡包埋，切片厚5 m。分别作h

染色、嗜银染色及c—fos免疫组织化学染色

四、试剂及方法

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试剂盒(武汉博士德公司)，按说明书进行操作。』f】

pbs取代一抗、二抗作阴性对照，以细胞核fi{现黄色

产物为阳性结果。硝酸银、氯化金、硫代硫酸钠、饱和

氨水，按ls—mrslnds染色法进行

五、图像分析及统计学处理

高倍视野f400)下分别对大脑皮质、丘脑以及脑

干随机选取5个视野．依次计数每个视野内阳性细胞

数，以其平均值作为该切片层面的阳性细胞数，以同

一动物6个切片层面的平均阳性细胞数作为该动物

的阳性细胞数各组动物再分别计算其组内阳性细胞

数。实验数据采用spss 10．0统计软件进行方差分析、

检验。

结果

一

、大体及镜下观察

实验组可见蛛网膜下腔出血，脑表面基本正常，

无大面积挫伤或局灶性挫裂伤灶。少数动物可见脑干

有灶性出血、侧脑室出血。未见脑组织局灶性病灶。镜

下可见神经元胞体明显肿胀，结构不清．核固缩，胞浆

红染加深．神经元损害主要分布于两侧大脑皮质。胶

质细胞肿胀明显。细胞周围间质水肿。嗜银染色示轴

索变粗、肿胀，呈串珠状、波浪状或螺旋状改变(图1)．

可见轴索断端膨大呈球形改变。

二、免疫组织化学染色

dbi后15min．即可观察到阳性反应细胞．呈散存

少量分布f图2)。阳性产物呈棕黄色，主要位于胞核

内，胞浆内以及大的突起根部也有表达。1 h后表达明

显增加(图3)，并于3 h达到高峰(图4)。随着损伤时间

延长，阳性反应细胞逐渐减少．24h后可见少量表达。

表达呈弥漫性．以皮层、脑干最为明显，不同部位的变

化趋势一致阳性反应细胞包括神经元及各类胶质细

胞 c—los基因表达的阳性细胞数，见表l 正常对照组

大脑皮质、丘脑以及脑干未见阳性反应细胞。

讨论

弥漫性脑损伤(diffus brin injury dbi)是一类常

见的、后果严重的原发性脑损伤，具有较高的致残率

· 43 ·

和病死率，在法医学中较常见。一般认为dbi主要包

括弥漫性轴索损伤、弥漫性脑肿胀、缺氧性脑损害、弥

漫性血管损伤等4种基本类型。[51 4种病理变化常可

同时存在。本实验采用mrmrou的模型制作方法．在

镜下可以观察到神经元肿胀，结构不清，核固缩改变。

细胞间质水肿明显。轴索增粗、肿胀，断端可见轴索球

形成等。符合dbi的病理学改变，并且随着损伤时间

的延长，上述病理学改变逐渐加重

原癌基因c—los是fbj和fbr小鼠特发性骨肉

瘤(msv)中病毒癌基因v—los的细胞同源物。c—los原

癌基[大j高度保守，小鼠、大鼠与人的los同源性分别为

97％和94％。人类的c—los基因定位于第14号染色体

(14q)．[61由3．5kb的dn片段组成，当c—los基因被

激活后迅速转录mrn，然后进入胞质．在胞质中合

成c—fos蛋白．之后较快地进入胞核，称为核磷酸蛋

白，它由380个氨基酸组成．其分子量为55kb，是

dn结合蛋白

c—fos基因为神经系统最常见的即刻早基因．在

外界刺激下数十分钟内c—fos基因即开始表达，其表

达产物c—fos蛋白与c—iun基因的表达产物c—iun蛋

白通过“亮氨酸拉链”形成f0s-jun异源二聚体．构成

p一1转录因子，进一步激活目的基因的表达。[7】c—fos

基因的表达在创伤的初始应答与继发性病理生理改

变之间可能成为重要的中介．f8如参与了细胞内外信

号传导、细胞凋亡及继发性颅脑损伤等。

本文应用mrmrou的弥漫性脑损伤模型研究了

c—los基因的表达情况。实验显示，打击后15 min，脑

皮层、脑干等部位中即出现c—los基因的表达，1 h后

表达明显增加，3 h达到高峰，整个鼠脑组织中，包括

脑皮层、皮层下、丘脑、脑干等区域均呈弥漫性表达，

不同部位的变化趋势一致，而后逐渐下降，24h后仍

可见少量表达。

关于脑创伤后c—los基因的表达机制据认为是通

过谷氨酸n一甲基一d一天门冬氨酸受体(nmdr)介导

的并随着谷氨酸释放增多而上升。i 9i谷氨酸的释放激

活神经细胞膜nmd受体，使受体活化而介导c—los

基因的表达另一种观点认为神经元中c—los基因的

表达是由lo播散性抑制(sprdin dprssion

sd)所致。㈣机械性损伤可以诱发sd，sd可将细胞外

c 转移至细胞内，造成细胞外cz 浓度下降，引起皮

层神经元去极化。c 内流及神经元去极化均可引起

c—los基因的表达。

本实验通过成功复制dbi动物模型．运用h、神

经纤维特殊染色以及免疫组化技术，不仅说明dbi存

在复杂的病理学改变．同时c—los 固表选的即时性

1技f『j问上的相对规律性．也为我们早期鉴定dbi手u推

断其掘协彝过时间提供了参考，、

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法律医学杂 2005年第l2卷f第1期)

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